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Identification d’ul24.5, une nouvelle protéine du virus de l’herpès simplex de type-1 impliquée dans la neuropathogénèse

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Dridi, Slimane (2018). Identification d’ul24.5, une nouvelle protéine du virus de l’herpès simplex de type-1 impliquée dans la neuropathogénèse Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, doctorat en immunologie et virologie, 165 p.

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Résumé

Le virus de l'herpès simplex (VHS-1) infecte les cellules épithéliales de la muqueuse où celui-ci se réplique. Le virus va ensuite infecter les terminaisons nerveuses et établir sa latence dans les ganglions nerveux sensitifs.

Le gène ul24 est conservé dans toute la famille des Herpesviridae et la protéine pUL24 est importante pour une réplication virale efficace et pour la pathogenèse in vivo. Il y a plusieurs transcrits exprimés à partir du gène ul24. La présence d'un site d’initiation interne à l’ORF UL24 dans le cadre de lecture ouvert d’ul24 et d'un codon d’initiation à la traduction ATG plus en aval dans le même cadre de lecture ouvert nous a fait suspecter qu'une autre protéine pourrait être exprimée à partir du locus ul24. Pour tester notre hypothèse, nous avons construit un virus recombinant qui exprime une étiquette d'hémagglutine (HA) à l'extrémité C-terminale de pUL24. L'analyse de l’expression protéique par immunobuvardage de type western a révélé l'expression d'une protéine de 17 kDa qui n'est pas un produit de dégradation de pUL24 pleine longueur. Afin de caractériser le rôle de la protéine nouvellement découverte nommée pUL24.5, nous avons construit un virus mutant codant pour une substitution de la méthionine d'initiation prédite par une valine (M122V). Cette substitution a éliminé l'expression du polypeptide de 17 kDa. Le mutant négatif UL24.5 présentait le même phénotype de réplication in vitro que la souche sauvage parentale. En revanche, l'absence de pUL24.5 au cours de l'infection in vivo a induit la persistance de maladie périoculaire et une augmentation de l'incidence de sévères troubles neurologiques. L'alignement des séquences d'acides aminés des protéines orthologues de pUL24 à travers les herpèsvirus a révélé que le codon d'initiation de la traduction de pUL24.5 est conservée parmi la souche VHS-1 (répertoriées sur NCBI) et, est présente dans de nombreux herpesvirus.

Enfin, nous avons utilisé un modèle de cellules épithéliales polarisées (CEP) pour étudier l'infection apicale (IA) ou basolatérale (IB) suite à l’infection par le VHS-1. Pour ces expériences nous avons utilisé les cellules Caco-2. Les mesures de résistance transépithéliale (TEER) et l'analyse par microscopie électronique ont confirmé la différenciation et la polarisation de la monocouche cellulaire. Pour évaluer le rôle de pUL24 et de pUL24.5 dans la réplication du VHS-1 dans les CEP, nous avons réalisé des IA ou des IB à forte MOI avec différents virus: le virus KOS de type sauvage, ou le virus déficient en UL24 nommé UL24X, ou le virus "Rescue" (vUL24X-Rescue) ou le virus déficient UL24.5 nommé vBAC_UL24.5negHA, ou le virus "Rescue" vBAC_UL24.5negHA-Rescue. Nous avons mesuré les titres viraux dans les différentes chambres suite aux différentes infections (IA ou IB). Les résultats ont montré qu'il n'y a pas de différence significative entre les titres viraux pour les virus KOS, vUL24X, vUL24Xrescue, vBAC_UL24.5negHA et vBAC_UL24.5negHA-Rescue lors de l’IA des CEP. En comparaison, en l'absence de pUL24, nous avons observé jusqu'à 10 fois la réduction des titres viraux par rapport à KOS, ce qui est similaire à la réduction observée pendant l'infection des cellules non polarisées. Fait intéressant, la réduction de 10 fois au cours de l’IB par vUL24X a été observée principalement dans la chambre apicale.

En conclusion, nous avons découvert un rôle pour le site d'initiation à la transcription interne à l'ORF UL24, impliqué dans l'expression de la nouvelle protéine découverte, pUL24.5. Des expériences in vivo avec vBAC_UL24.5negHA ont montré qu'en l'absence de pUL24.5, il existe une persistance prolongée des signes inflammatoires ainsi qu'une augmentation de l'incidence de troubles neurologiques sévères. Ainsi, pUL24.5 est un nouveau déterminant pour la pathogénèse du VHS-1.

Les expériences d'infection dans les CEP ont montré que, comme dans les cellules épithéliales non-polarisées, pUL24.5 n'était pas important pendant la réplication du VHS-1. En revanche, l'absence de pUL24 semble affecter spécifiquement l’IB par le VHS-1 et en particulier la sortie apicale des virions néo-synthétisés. Cependant, l'impact de la perte de pUL24 était de la même ampleur que celui observé dans les cellules non-polarisées.

Abstract

Herpes simplex virus (HSV-1) infects the host via epithelia and spreads to sensory neurons where latency is established. The ul24 gene is conserved throughout the Herpesviridae family, and the UL24 protein is important for efficient viral replication and in pathogenesis. There are multiple transcripts expressed from the ul24 gene. The presence of a transcription start site within the open reading frame of ul24 (ORF UL24) and of a potential start codon ATG further downstream in the same open reading frame led us to suspect that another protein was expressed from the ul24 locus. To test our hypothesis, we constructed a recombinant virus that expresses a hemagglutin-tag at the C-terminus of pUL24. Western blot analysis revealed the expression of a 17 kDa protein that is not a degradation product of full-length pUL24. In order to characterize the role of the newly discovered protein referred to as pUL24.5, we constructed a mutant virus encoding a substitution of the predicted initiation methionine to a valine. This substitution eliminated expression of the 17 kDa polypeptide. The UL24.5 negative mutant exhibited the same replication phenotype in vitro as the parental strain. In contrast, the absence of UL24.5 during infection in vivo led to a prolonged period of periocular disease and an increase in the incidence of severe neurological impairment. Alignment of amino acid sequences for various herpesviruses revealed that the initiation methionine of UL24.5 is conserved among HSV-1 strains and is present in many alphaherpesviruses.

Finally, we used a model of polarized epithelial cells (Caco-2) to study basolateral infection and apical infection by HSV-1. Measurements of transepithelial resistance (TEER) and electron microscopy analysis have confirmed the differentiation and polarization of the cell monolayer. To evaluate the role of pUL24 and pUL24.5 in the replication of HSV-1 in polarized epithelial cells, we carried out apical or basolateral infections at a high MOI with different viruses: the wild-type KOS virus, or the UL24-deficient virus named UL24X, or the "Rescue" virus (vUL24X-Rescue) or the UL24.5 deficient virus named vBAC_UL24.5negHA, or the virus "Rescue" vBAC_UL24.5negHA-Rescue. We measured the viral titers in the different chambers following apical or basolateral infection. The results showed that there was no significant difference between virus titers for KOS, vUL24X, vUL24Xrescue, vBAC_UL24.5negHA and vBAC_UL24.5negHA-Rescue viruses upon apical infection of the polarized cells. In comparison, upon basolateral infection in the absence of pUL24, we observed up to a 10-fold reduction of viral titers as compared to KOS, which is similar to the reduction observed during infection of non-polarized cells. Interestingly, the 10-fold reduction during basolateral vUL24X infection was observed mainly in the apical chamber.

In conclusion, we have discovered a role for the transcription initiation site within the ul24 ORF namely the expression of the pUL24.5 protein, which we have recently discovered. In vivo experiments with vBAC_UL24.5negHA have shown that in the absence of pUL24.5, there is a prolonged persistence of inflammatory signs as well as an increase in the incidence of severe neurological disorders. Thus, pUL24.5 is a new HSV-1 determinant of pathogenesis.

The infection experiments in polarized cells showed that, just like in non-polarized epithelial cells, pUL24.5 was not important during HSV-1 replication. In contrast, the absence of pUL24 seemed to specifically affect basolateral infection with HSV-1, particularly with regard to apical egress of neo-synthesized virions. However, the impact of the loss of pUL24 was of the same magnitude as that observed in non-polarized cells.

Type de document: Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Pearson, Angela
Mots-clés libres: VHS-1, UL24.5, UL24, pathogénèse virale, neuropathogénèse virale, cellules épithéliales polarisées; viral pathogenesis, viral neuropathogenesis, polarized epithelial cells
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 27 sept. 2018 21:00
Dernière modification: 27 sept. 2018 21:00
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/7610

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