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Infectability of primary human neural cells by 1-1Utv1AN corona viruses 229E and OC43

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Bonavia, Aurelio (1995). Infectability of primary human neural cells by 1-1Utv1AN corona viruses 229E and OC43 Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 191 p.

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Résumé

Les coronavirus humains se regroupent en deux souches sérotypiques, 229E et OC43, et causent des maladies respiratoires(Myint, 1994), gastro-intestinales (Resta et al., 1985), et ont été associés à des myocardites (Riski and Hovi, 1980). Plusieurs observations suggérent que les coronavirus humains pourraient aussi être neurotropes. Des particules coronavirales furent observées dans des échantillons provenant de cerveaux de patients atteints de sclérose en plaques (Tanaka et al .. 1976). Des taux d'anticorps anticoronavirus humains élevés ont aussi été trouvés dans le liquide céphalo-rachidien de patients atteints de sclérose en plaques, ce qui suggère une implication possible de ce virus dans l'étiologie de la maladie (Salmi et al., 1982). Deux souches de coronavirus ont été isolées a partir d'échantillons provenant du cerveau de patient atteints de sclérose en plaques (B urks et al., 1980) et l'inoculation intracérebrale de ces virus à des primates a provoqué une maladie démyélinisante (1\1urray et al.. 1992). En plus, le génome du coronavirus humain 229E (HCV-229E) a été amplifié à partir d'échantillons de patients atteints de sclérose en plaque mais pas de témoins (Stewart et al .. 1992).

Ces études sont en accord avec l'hypothèse que les coronavirus humains pourraient être impliqués dans l'étiologie de maladies neurologiques comme la sclérose en plaques. Par contre, le neurotropisme comme tel n' a pas été prouvé jusqu'à date. Des études avec des lignées continues ont démontré que les coronavirus humains peuvent infecter des cellules nerveuses murines et humaines, et que l'infection est productive (Pearson and Mims, 1985; Talbot et al., 1994; Talbot, communication personnelle). Toutefois, ces lignées cellulaires étant immortalisées, il est possible que leur infection ne reflète pas correctement le contexte naturel. Le but du projet de maîtrise était, donc de déterminer l'infectabilité des cellules nerveuses humaines en culture primaire par les coronavirus humains 229E et OC43, une étape importante dans la démonstration du neurotropisme des coronavirus humains, les cultures primaires se rapprochant le plus de la situation in vivo.

Pour détecter les :11Higènes vitaux exprimés dans les cellules infectées, nous avons utilisé la méthode d'immunofluorescence indirecte. Pour dé tee ter les antigènes produits par HCV -229E, nous avons utilisé 1 'anticorps monoclonal 5-11 H.6 et un anticorps polyclonal de lapin, les deux dirigés contre 229E. Nous n'avons pas pu détecter la présence d'antigènes viraux, 111 clans les cellules humaines neuronales et astrocytaires foetales, ni clans les microglies, oligodendrocytes ou astrocytes adultes humains. Pour détecter les antigènes d'HCV-OC43, nous avons utilisé 1 'anticorps monoclonal 4-Ell.3 anti-HEV et un anticorps polyclonal cie cobaye anti-OC43. Ce dernier anticorps fut produit expressément pour les expériences présentées ici. Des antigènes de HCV -OC43 ont été détectés dans des cellules humaines astrocytaires foetales, microglies et astrocytes adultes, mais n'ont pas été détectés dans les neurones foetaux m dans les oligodendrocytes.

Étant donné les résultats négatifs en immunofluorescence dans le cas de HCV-229E, nous avons utilisé une technique beaucoup plus sensible, le RT -PCR/Southern blotti ng, qui permet de détecter 1 'ARN viral dans des cellules infectées. Avec cette technique, nous avons pu détecter l' ARN de 229E dans des cellules humaines astrocytaires foetales, microglies adultes et dans un mélange d' oligodendrocytes et astrocytes adultes. Les échantillons de neurones étant très difficiles à obtenir, ils n'ont pas pu être testés avec cette technique. adultes.

Nous avons aussi pu détecter par microscopie électronique la présence d'HCV -OC43 dans des astrocytes foetaux infectées en utilisant la méthode des coupes ultra-minces.

Nous avons détecté et quantifié les particules virales infectieuses produites après l'infection clés cultures primaires par la méthode d'immunoperoxydase indirecte. Des particules infectieuses d'HCV-229E et d'HCV-OC43 ont ainsi été détectées dans des cultures d'astrocytes foetaux infectés. Également, un taux très bas de particules infectieuses d'HCV-OC4 a été détecté dans les cultures de microglies et d'oligodendrocytes/astrocytes adultes. La différence dans les titres de vus produits pourrait être due à la différence dans la concentration de cellules clans chaque échantillon. Étant donné que nous avons travaillé avec des cultures primaires, nous ne pouvions pas contrôler ce paramètre.

Finalement, nous avons produit cinq hybridomes sécrétant des anticorps monoclonaux an ti-OC43.

Les résultats de ce projet de recherche montrent l'infectabilité de certains types de cellules gliales humaines par les deux souches prototypes du coronavirus humain.

La différence clans les degrés d'infectabilité par les deux souches du coronavirus humain n'est pas surprenante car ce phénomène a été montré dans le modèle de souris (Dubois-Dalcq et al., 1982; Gagneten et al., 1995). Le type de cellules qui sont infectables est similaire à celui observé dans l'étude fait avec HCV-OC43 et les cellules nerveuses primaires de souris et clans celui fait avec des cultures primaires foetales humaines (Pearson et !\1ims, 1985). Il est intéressant de constater que les résultats clans le modèle de souris concordent avec les résultats chez l'humain. Par contre, les résultats obtenus en culture primaire ne correspondent pas tout à fait avec ceux en lignées continues où les deux souches virales, 229E et OC43 montrent une haute infectabilité. un grand taux de production virale et où tous les types de cellules nerveuses sont infectables (Talbot, communication personnelle). Même si notre étude présente de l'information plus détaillée dans la caractérisation de 1 'infection des cellules nerveuses humaines par les coronavirus humains, il y encore beaucoup à faire dans le domaine pour comprend re le neurotropisme des corona virus, et faire le lien avec des maladies neurologiques. Finalement, il est intéressant de noter que les coronavirus humains semblent infecter les mêmes types de cellules nerveuses que le virus de l'immunodéficience humaine, soit les astrocytes et les microglies (Sharpless et al., 1992).

Abstract

The goal of this project was to determine the infectability of human primary cultured neural cells by human coronaviruses (HCV) 229E and OC43.

To detect viral antigens expressed m infected cells we used an indirect immunofluorescence technique. To detect antigens of HCV-229E we used monoclonal antibody 5-IIH.6 and a rabbit polyclonal antiserum, both anti-229E . \Ve could not detect the presence of viral antigens in infected human fetal neurons, fetal astrocytes, adult microglia, adult oligodendrocytes or adult astrocytes. To detect antigens of HCY -OC43 we used monoclonal an ti body 4-E 11.3 anti-HEV and a guinea pig polyclonal antibody to OC43. The latter reagent was produced for these experiments. Viral antigens were detected in infected human ferai astrocytes, a du lt microglia and adult astrocytes but not in fetal neurons and adult oligodendrocytes.

Finally, five hybridomas secreting monoclonal antibodies directed against HCV -OC43 were produced.

To verify the negative results obtained with HCV -229E we used a more sensitive technique, RT -PCR/Southern-blotting, to detect viral RNA in infected cells. With this method, we could detect HCV -229E RNA in fetal astrocytes, adult microglia and in a mtx of adult oligodendrocytes and astrocytes. The neuron samples were scarce so we could not test them with this technique.

Also, we have detected the presence of HCV-OC43 in infected cells by electron microscopy of ultra-thin sections.

We have detected and quantified the infectious particles produced after infection of the primary cultures using the indirect immunoperoxidase method. Infectious HCV -229E and HCV-OC43 particles were detected in cultures of infected fetal astrocytes. Low amounts of infectious OC43 were also detected in infected adult astrocytes, oligodendrocytes and microglial cultures possible for HCV-229E.

We have detected and quantified the infectious particles produced after infection of the primary cultures using the indirect immunoperoxidase method. Infectious HCV -229E and HCV-OC43 particles were detected in cultures of infected fetal astrocytes. Low amounts of infectious OC43 were also detected in infected adult astrocytes, oligodendrocytes and microglial cultures.

Type de document: Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Talbot, Pierre
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 08 sept. 2018 21:46
Dernière modification: 08 sept. 2018 21:46
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/7578

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