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Étude de la réponse immunitaire humorale contre l'infection par le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin

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Loemba, Hugues Dieudonné (1995). Étude de la réponse immunitaire humorale contre l'infection par le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 251 p.

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Résumé

Le syndrome reproducteur et respiratoire porcin (SRRP) est une nouvelle maladie porcine qui est caractérisée par des troubles de la reproduction accompagnés par des problèmes respiratoires. Ces signes respiratoires sont observés chez les porcelets à la mamelle, les porcelets sevrés et les porcs à l'engraissement et ils sont attribuables à une pneumonie interstitielle ou une pneumonie proliférative et nécrosante. Cette maladie est d'abord apparue en Amérique du nord vers la fin des années 80 et s'est répandue très rapidement dans plusieurs pays européens vers le début des années 90. L'agent causal fut pour la première fois identifié en 1991 en Hollande et désigné virus de Lelystad. Peu de temps après, des chercheurs en Europe et en Amérique du nord, et en particulier au Québec, ont isolé des virus possédant les caractéristiques morphologiques du virus néerlandais et sérologiquement associés à ce dernier. Ces virus furent isolés sur cultures primaires de macrophages alvéolaires de porcs à partir des spécimens cliniques provenant de fermes affectées par la maladie aux États-Unis, au Canada et au Québec.

Le virus du SRRP fait partie du genre des Artérivirus, classé provisoirement dans la famille Togaviridae, en regard de ses caractéristiques morphologiques. Sur le plan de son organisation génomique et de sa stratégie de réplication, le virus du SRRP est très proche des virus de la famille Coronaviridae. Il existe différents variants antigéniques du virus du SRRP et certains isolats se distinguent par leur pathogénicité particulière.

Les objectifs de ce projet de recherche étaient d'étudier la réponse immunitaire humorale des porcs atteints du SRRP, d'établir la chronologie d'apparition des anticorps, d'identifier les polypeptides viraux impliqués dans l'induction de la réponse immunitaire humorale, ainsi que d'évaluer différentes techniques pouvant être utilisées pour le suivi sérologique de cette infection virale.

La souche cytopathique de référence du Québec IAF-Klop fut utilisée dans cette étude et propagée sur cellules MARC-145, une lignée hautement permissive au virus du SRRP, dérivée de cellules de reins de singes. L'identification sérologique de la souche IAF-Klop a été confirmée par immunofluorescence indirecte, utilisant des anticorps monoclonaux dirigés contre la proteine N de la nucléocapside de la souche de référence américaine ATCC-VR2332. Le virus a été cloné par la technique des plages; des antisérums homologues ont été obtenus suite à l'immunisation de porcs et de lapins avec les préparations de virus purifié par ultracentrifugation isopycnique sur gradients de densité de chlorure de césium ou de saccharose.

Différentes infections expérimentales ont été réalisées chez des porcelets de cinq semaines d'âges et exempts d'agents pathogènes spécifiques (SPF), ce qui a permis d'obtenir des échantillons cliniques prélevés hebdomadairement pour l'évaluation de la réponse immunitaire humorale et le suivi de la virémie. Cinq types d'infections expérimentales ont été réalisées:

1- Une étude cohorte-sentinelle où les porcelets SPF ont été introduits dans un élevage ayant des évidences cliniques et sérologiques du SRRP.

2- L'infection expérimentale de porcelets SPF avec une dose unique intranasale de 105 DECP50 de la souche IAF-exp91 propagée sur cultures de macrophages alvéolaires.

3- Une expérience de surinfection où des porcelets SPF ont reçu une dose intranasale initiale de 105 DECP50 du virus du SRRP, suivie d'une dose de rappel au 35ième jour de la maladie.

4- Une expérience d'hyperimmunisation où des porcelets SPF ont été infectés par voie intranasale, puis ont reçu des doses de rappel à toutes les deux semaines.

5- Une infection virale mixte où les porcelets ont reçu initialement une dose intranasale de la souche IAF-Klop du virus du SRRP, suivie d'une dose intranasale de la souche A/SW/IAF-5393/QC9l(H1Nl) du virus de l'influenza porcin au septième jour post-infection.

Les animaux infectés de même que les porcelets témoins, ont été gardés pour une période d'observation de sept à quatorze semaines. Suite aux diverses infections expérimentales, les porcs ont développé des signes cliniques du SRRP, à savoir une hyperthermie ou une subfébrilité intermittante, une asthénie et une anorexie, une dyspnée, une conjonctivite ainsi qu'une cyanose des extrémités. Lors de la nécropsie, les principales lésions macroscopiques observées chez les porcs infectés étaient localisées au niveau des poumons. Il y avait généralement une congestion diffuse et une hépatisation du tissu pulmonaire, associées à des adénopathies médiastinales et paratrachéales satellites. Histologiquement, cette atteinte pulmonaire était liée à une pneumonie interstitielle.

Des tests d' immunofluorescence indirecte { IFI), de séroneutralisation (SN) et d'immunobuvardage (WB) ont été effectués pour suivre la cinétique des titres des différents anticorps et pour établir la spécificité polypeptidique de la réponse immunitaire humorale. Indépendamment du type d'infection réalisée, peu de différences au niveau de la cinétique de la réponse immunitaire en anticorps chez les porcelets a été notée. En général, les IgM étaient détectés dès la fin de la première semaine de l'infection. Puis leurs titres atteignaient un niveau maximal vers le 14ième jour après exposition au virus du SRRP, pour ensuite décroître sous des valeurs non significatives au 35ième ou 42ième jour. Les IgG, pour leur part, étaient détectés au cours de la deuxième semaine de l'infection et leurs titres augmentaient rapidement pour atteindre une valeur-plateau vers le 28ième jour ou le 35ième jour; toutefois des titres élevés étaient maintenus pour plus de 3 mois après le début de l'infection. Des titres significatifs en anticorps neutralisants (>1:16) n'ont pas été observés avant la 4ième ou 5ième semaine de l'infection. Le virus fut isolé sur cultures cellulaires à partir des sérums des porcs infectés dès le 3ième jour d'infection jusqu'à la fin de la période d'observation. Ces résultats confirment ainsi la persistance du virus du SRRP, en dépis des titres relativement élevés en anticorps circulants.

Les séquences correspondant aux cadres de lecture ORFs 4, 5, 6 et 7 ont été amplifiées à l'aide de la technique de réaction de la Taq polymérase, puis clonées dans les vecteurs d'expression procaryotes pMALm-2 et pGEX-4T. Les gènes ont par la suite été exprimés dans les cellules bactériennes E.coli transformées par les plasmides recombinants. La réactivité des sérums d'animaux infectés envers les produits codés par ces cadres de lecture, a été sui vie par imrnunobuvardage. Les animaux infectés ont développé des anticorps contre les quatres protéines virales obtenues après expression des gènes amplifiés et clonés. Une réponse immunitaire humorale spécifique à chaque protéine du virus du SRRP a été mise en évidence; les anticorps dirigés contre la protéine d'enveloppe (E) codée par l'ORF5 et ceux contre le produit de l'ORF4 étaient détectables vers le 7ième jour après infection, tandis que les anticorps spécifiques à la protéine N de la nucléocapside (produit de l'ORF7) n'étaient décelables qu'à partir du 14ième jour d'infection. Finalement les anticorps produits contre la protéine de la matrice M (produit de l'ORF6) n'ont pu être mis en évidence qu'au début de la troisième semaine.

Les résultats obtenus ont démontré qu'il existait une chronologie particulière d'apparition des différents types d'anticorps produits chez les animaux infectés et une réponse immunitaire humorale spécifique dirigée contre chacune des protéines du virus du SRRP. Toutefois, aucune corrélation n'a été observée entre les titres des anticorps détectés par immunofluorescence, les titres en anticorps neutralisants, la spécificité polypeptidique de la réponse humorale et la virémie révélée au cours de l'infection.

Enfin, les tests sérologiques utilisés au cours de ce recherche, ont permis de révéler l'efficacité de certaines épreuves telle · que l'immunofluorescence indirecte et l'immunobuvardage pour le suivi sérologique de l'infection par le virus du SRRP. La Technique de la RT-PCR a permis de confirmer le statut virémique des porcs infectés ayant été déterminé par les tests d'isolement viral à partir du sérum; toutefois, il est nécessaire d'approfondir l'étude des paramètres pouvant améliorer la sensibilité de cette technique pour la détection du génome viral à partir des échantillons cliniques.

Type de document: Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Dea, Serge
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 08 sept. 2018 21:54
Dernière modification: 08 sept. 2018 21:54
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/7559

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