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Développement de modèles cellulaires pour la détection de la perturbation promoteur-spécifique de l'aromatase (CYP19) chez l'humain par des pesticides néonicotinoïdes

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Caron-Beaudoin, Elyse (2017). Développement de modèles cellulaires pour la détection de la perturbation promoteur-spécifique de l'aromatase (CYP19) chez l'humain par des pesticides néonicotinoïdes Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en biologie, 258 p.

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Résumé

L’aromatase (CYP19) est une enzyme clé de la synthèse des oestrogènes, dont le gène est exprimé de façon promoteur-spécifique. Dans la glande mammaire saine, CYP19 est faiblement exprimé sous la régulation du promoteur I.4. Lors d’un cancer du sein hormono-dépendant, les fibroblastes entourant la tumeur expriment fortement CYP19 via un changement d’utilisation des promoteurs (inhibition de l’activité du promoteur I.4 et augmentation de l’activité des promoteurs PII, I.3 et I.7). CYP19 est aussi exprimé dans le placenta via les promoteurs I.1 et I.8. Pendant la grossesse, les oestrogènes sont nécessaires à la formation du syncytiotrophoblaste ainsi qu’au développement de la circulation sanguine utéro-placentaire. Une perturbation de la production d’oestrogènes pendant cette période est associée à certains problèmes de santé chez les nouveau-nés. Cependant, nous détenons peu d’informations sur l’effet des contaminants sur l’expression promoteur-spécifique de l’aromatase. L’objectif de cette étude était de développer des modèles cellulaires afin de mesurer l’effet de pesticides largement utilisés, les néonicotinoïdes, sur l’expression promoteur-spécifique et l’activité de l’aromatase dans les contextes du cancer du sein et de la grossesse. Les objectifs spécifiques étaient de 1) développer des méthodes RT-qPCR afin d’identifier les promoteurs impliqués dans l’expression de CYP19 dans différentes lignées cellulaires (H295R, HUVEC, Hs578t, BeWo) ; 2) mesurer l’expression promoteur-spécifique et l’activité catalytique de l’aromatase dans ces lignées cellulaires exposées à des néonicotinoïdes; 3) identifier les voies de signalisation cellulaire impliquées dans le changement d’utilisation des promoteurs, et les effets des néonicotinoïdes sur ce phénomène dans un modèle de cancer du sein ; 4) mesurer les effets des néonicotinoïdes sur l’activité catalytique de l’aromatase et la production hormonale dans un modèle mimant la stéroïdogenèse foeto-placentaire. Toutes les lignées cellulaires et le modèle de co-culture ont été exposés pendant 24h à des inducteurs de l’expression de CYP19 via différents promoteurs, ou à des concentrations de néonicotinoïdes semblables à celles retrouvées dans l’environnement et populations d’agriculteurs. Cette étude est la première à démontrer que le promoteur normal I.4, ainsi que les promoteurs « pro-cancers » PII, I.3 et I.7 de CYP19 sont actifs dans les cellules Hs578t. De plus, l’activité des promoteurs PII, I.3 et I.7 dans les cellules Hs578t est en partie dépendante de l’activation de deux voies de signalisation VEGF (MAPK1/3 et PLC). L’exposition des cellules Hs578t à l’imidaclopride et au thiaclopride a résulté en un changement d’utilisation des promoteurs de CYP19, soit une inhibition de l’activité du promoteur I.4 au profit des promoteurs PII, I.3 et I.7, menant à une augmentation de l’activité de l’aromatase. Une exposition au thiaclopride et au thiaméthoxame dans les cellules H295R a également induit l’expression de CYP19 via l’activité des promoteurs PII et I.3, ainsi que l’activité catalytique de l’aromatase. Dans le modèle foeto-placentaire, les trois néonicotinoïdes ont augmenté l’activité catalytique de l’aromatase et la production de 17β-oestradiol et d’oestrone, mais ont inhibé la production d’oestriol par leur action sur l’enzyme CYP3A7. Cette étude démontre que des concentrations environnementales de néonicotinoïdes peuvent perturber l’expression promoteur-spécifique et l’activité catalytique de l’aromatase, ainsi que la production d’oestrogènes dans des modèles in vitro pertinents pour l’étude du cancer du sein et de la stéroïdogenèse par l’unité foeto-placentaire. Finalement, nous avons démontré que ces pesticides largement utilisés sont de potentiels perturbateurs endocriniens.

Abstract

Aromatase (CYP19) is a key enzyme in the biosynthesis of estrogen and is expressed in a promoter-specific manner. In the healthy mammary gland, CYP19 is expressed at low levels under the regulation of its I.4 promoter. In hormone-dependent breast cancer, fibroblasts surrounding the tumor express increased levels of CYP19 due to a switch in promoter usage (decrease of I.4 promoter activity and an increase in the usage of the PII, I.3 and I.7-promoters of CYP19). CYP19 is also highly expressed in the placenta under the regulation of the I.1 and I.8 promoters. During pregnancy, estrogen production is necessary to ensure the formation of the syncytiotrophoblast and the development of the utero-placental blood flow. Disruption of estrogen during pregnancy is associated with birth and pregnancy outcomes. Little is known about the effects of environmental chemicals on the promoter-specific expression of CYP19. The general aim of this thesis was to develop screening bioassays to measure effects of widely-used neonicotinoid insecticides on the promoter-specific expression and activity of aromatase in cellular models relevant to breast cancer and pregnancy. The specific objectives were to 1) develop RT-qPCR methods to identify the promoters implicated in CYP19 expression in various cellular models (H295R, HUVEC, Hs578t, BeWo); 2) measure the promoter-specific expression and catalytic activity of aromatase in these cell lines exposed to widely-used neonicotinoids; 3) identify the signalling pathways implicated in the switch of promoter usage, and the effects of neonicotinoids on this process in a breast cancer-relevant cellular model; 4) measure the effects of neonicotinoids on aromatase catalytic activity and hormone production in a feto-placental co-culture model. All cell lines and co-culture model were exposed for 24h to inducers of specific CYP19 promoters, or environmentally-relevant concentration of neonicotinoids. This study is the first to demonstrate that the normal I.4 promoter of CYP19 as well as the breast cancer-relevant PII, I.3 and I.7 promoters are active in Hs578t cells. We found that the expression of CYP19 via the PII, I.3 and I.7 promoters in Hs578t is, in part, dependent on the activation of two VEGF signaling pathways, those of mitogen activated protein kinase (MAPK) 1/3 and phospholipase C (PLC). Exposure of Hs578t cells to environmentally relevant concentrations of imidacloprid and thiacloprid resulted in a switch in promoter usage for CYP19 expression, involving an inhibition of normal I.4 promoter activity, whereas PII, I.3 and I.7 promoter-derived CYP19 expression was strongly increased, leading to overall induction of aromatase catalytic activity. We determined that thiacloprid and imidacloprid exerted their effects by inducing the MAPK 1/3 and/or PLC pathways. Thiacloprid and thiamethoxam also induced CYP19 expression via PII and I.3 promoters, as well as aromatase catalytic activity in H295R cells. Thiacloprid, imidacloprid and thiamethoxam induced aromatase catalytic activity, as well as 17β-estradiol and estrone production in the feto-placental co-culture model. These neonicotinoids interestingly inhibited estriol production (estrogen uniquely produced during pregnancy) by potentially binding to the CYP3A7 enzyme. This research shows that environmentally-relevant concentrations of neonicotinoids can alter the promoter-specific expression of CYP19, its catalytic activity and estrogen production in in vitro models relevant to breast-cancer and feto-placental steroidogenesis. Overall, we have highlighted the endocrine disrupting potential of these widely-used insecticides.

Type de document: Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Sanderson, J. Thomas
Mots-clés libres: aromatase, expression promoteur-spécifique, oestrogènes; cancer du sein hormono-dépendant; unité foeto-placentaire; perturbateurs endocriniens; néonicotinoïdes; Hs578t; H295R; promoter-specific expression; estrogen; hormone-dependant breast cancer; feto-placental unit; endocrine disruptors; neonicotinoids
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 14 mars 2018 14:05
Dernière modification: 14 mars 2018 14:18
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/6841

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