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Isolement des cellules basales épididymaires et caractérisation de nouvelles fonctions.

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Mandon, Marion (2015). Isolement des cellules basales épididymaires et caractérisation de nouvelles fonctions. Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en biologie, 232 p.

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Résumé

L’épididyme joue un rôle important dans l’acquisition de la fertilité, en permettant aux spermatozoïdes d’acquérir mobilité et pouvoir fécondant lors de leur progression dans la lumière. Cette maturation ne peut se faire que grâce à un environnement spécifique qui garantit la protection des spermatozoïdes et est maintenu par la barrière hémato-épididymaire. Cette barrière est formée de jonctions serrées entre les cellules de l’épithélium, et isole le compartiment luminal du compartiment basal.

Les cellules basales de l’épididyme sont localisées à la base de l’épithélium et possèdent des projections apicales minces régulées par des facteurs testiculaires, qui seraient capables de traverser la barrière hémato-épididymaire et d’atteindre la lumière du tubule, notamment au niveau des jonctions tripartites. En plus de la participation à la barrière hémato-épididymaire, il a été suggéré un rôle de détoxification, une fonction immunitaire et un rôle de régulation des fonctions d’autres cellules épithéliales. L’un des principaux obstacles à l’étude des cellules basales de l’épididyme est l’absence de protocole pour les isoler.

L’objectif principal de ce projet était de caractériser la participation des cellules basales à la barrière hémato-épididymaire via la jonction tricellulaire, et d’étudier les voies de signalisation pouvant être impliquées dans cette participation. Trois sous-objectifs étaient nécessaires : (1) Etudier l’expression et la localisation de la tricelluline dans l’épididyme et déterminer si les cellules basales participent à la barrière hémato-épididymaire par le biais de cette protéine. (2) Mettre au point une méthode pour isoler les cellules basales. (3) Etablir le profil d’expression génique des cellules basales afin de pouvoir étudier les gènes et voies de signalisation spécifiques à ces cellules.

Les résultats ont montré que la tricelluline était exprimée dans tous les segments de l’épididyme à des niveaux similaires, et que les niveaux de tricelluline augmentaient avec l’âge ; le marquage passe de cytoplasmique aux marges latérales de la membrane plasmique puis au niveau apical. La colocalisation de la tricelluline avec l’occludine a permis de vérifier que la tricelluline se situait bien au niveau des jonctions serrées. La colocalisation de la tricelluline et d’un marqueur des cellules basales, la cytokératine 5 (ou KRT5), a démontré que la cellule basale ne participait pas à la jonction tricellulaire. Enfin, des expériences de knock-down par ARN interférent ont permis de montrer que la résistance transépithéliale décroît lorsqu’on inhibe l’expression de la tricelluline. On a également observé une diminution de l’expression d’autres protéines de jonction telles l’occludine, la claudine-1 et la claudine-3. D’autres protéines de jonction, comme ZO-1 et E-cadhérine, ne sont pas altérées. Nos résultats ont donc permis de démontrer le rôle de la tricelluline dans l’épididyme, et de montrer que les cellules basales n’étaient pas impliquées dans la jonction tricellulaire. Isoler les cellules basales était nécessaire pour étudier leurs fonctions.

Les différents protocoles retrouvés dans la littérature n’ont pas permis d’obtenir une population pure de cellules basales. Nous avons donc mis au point une méthode d’isolement par séparation magnétique basée sur l’intégrineα6. L’efficacité de cette séparation a été vérifiée par cytométrie en flux, immunofluorescence et PCR, prouvant un enrichissement de cellules basales d’environ 90%. De la microscopie électronique a permis de caractériser morphologiquement les cellules basales. Nous avons donc mis au point un protocole efficace et reproductible pour isoler les cellules basales, ce qui a permis d’effectuer ensuite leur profil d’expression génique.

A partir de l’ARN des différentes fractions obtenues par séparation magnétique, nous avons fait des expériences de microréseaux. Ces données ont permis de déterminer que 552 gènes, dont 45 avec un ratio de 5 fois ou plus, étaient enrichis dans les cellules basales par rapport aux autres cellules de l’épididyme. Ces gènes hautement exprimés ont été montrés comme codant pour des protéines impliquées entre autres dans l’adhésion cellulaire, le fonctionnement du cytosquelette, le transport d’ions, la signalisation cellulaire. Plusieurs gènes hautement exprimés ont été retrouvés dans des cellules progénitrices adultes, suggérant que les cellules basales pourraient représenter une population de cellules souches épididymaires. Ces fonctions de cellules souches dans l’épididyme ont été démontrées in vitro en cultivant les cellules basales pendant 14 jours, ce qui a permis de montrer une prolifération et une réorganisation des cellules basales ainsi que des modifications dans l’expression de certains marqueurs.

Les données obtenues dans ce travail de thèse permettent donc de montrer que (1) les cellules basales épididymaires ne sont pas impliquées dans la jonction serrée tricellulaire. (2) La séparation magnétique par l’intégrine-α6 est une méthode reproductible et efficace pour isoler les cellules basales. (3) Le premier profil d’expression génique des cellules basales épididymaires de rat ainsi que le développement d’une méthode de culture de ces cellules suggèrent fortement que ces cellules pourraient agir comme des cellules progénitrices multipotentes de l’épithélium épididymaire.

Abstract

The epididymis plays a critical role in fertilization by enabling spermatozoa to acquire motility and fertilization ability as they transit through the lumen. This maturation is accomplished by a specific luminal microenvironment in the epididymis, which protect spermatozoa from immune attack and which is maintained by the blood-epididymis barrier. This barrier is formed by tight junctions between epithelial cells, and partitions the epithelium into luminal and basal compartments.

Basal cells are epididymal epithelial cells localized at the base of the epithelium. They typically display thin apical projections, regulated by testicular factors, which may extend through the blood-epididymis barrier at tricellular junctions. While some epithelial cells have been well studied, basal cells are relatively unknown. In addition to participation in the blood-epididymis barrier, several other roles have been suggested, including detoxification, immune function, and regulation of other epithelial cell functions, either directly via apical projection or indirectly, via hormone synthesis, such as prostaglandins. One of principal difficulties limiting the study of basal cells is the absence of a valid isolation protocol.

The objective of this project was to characterize the participation of basal cells in the blood-epididymis barrier through tricellular tight junctions, and to study the pathways implicated in this participation. This objective was divided into three parts : (1) To study the expression and localization of tricellulin in the epididymis, and determine if basal cells participate in the blood-epididymis barrier through this protein. (2) To establish a reliable and reproducible method to isolate epididymal basal cells. (3) To establish the gene expression profile of epididymal basal cells and predict genes and pathways implicated in these cells.

Localization of tricellulin was studied in the adult rat epididymis as well as at various stages of postnatal development, by immunofluorescence. Protein localization changed during postnatal development from cytoplasmic to membrane-bound as a function of age. Tricellulin protein expression in the adult and during postnatal development was assessed by Western-blot. In addition, co-localization studies between tricellulin and occludin were conducted in order to verify the localization of tricellulin at tight junctions. Participation of basal cells in tricellular junctions was confirmed by co-localization between tricellulin and cytokeratin 5, a marker of basal cells. Finally, knockdown of tricellulin was achieved using small interfering RNA (siRNA) in our rat caput epididymal principal cell line. These experiments demonstrated a decrease of transepithelial resistance, which was correlated with decreased levels of claudin-1, claudin-3 and occludin. Zonula occludens 1 and cadherin1 levels were unchanged. Our results therefore demonstrate the role of tricellulin in epididymis, and show that basal cells are not necessarily involved in tricellular tight junction.

In order to elucidate basal cell functions, it was necessary to develop a reproducible protocol for the isolation of highly purified basal cells. Various isolation protocols reported previously in the literature (density gradients or magnetic separation) have not yielded a sufficiently pure population of basal cells. We have developed a new method, based on magnetic separation of basal cells using integrin-α6 as a basal cell marker. The efficiency of this method was verified by flow cytometry, immunofluorescence and RT-PCR, all of which indicated a purity of the isolated basal cell fraction as close to 90%. Electron microscopy was also performed, in order to further characterize epididymal basal cell morphology. We are therefore satisfied that we have achieved an efficient and reproducible protocol to isolate epididymal basal cells, which has permitted us to elaborate basal cell morphology and further characterize their properties.

Using mRNA extracted from the different fractions obtained by magnetic separation (positive or basal cell, and negative or non-basal cell fractions), we performed microarray experiments. These data demonstrated that 552 genes were differentially expressed. Of these, 45 exhibited a ratio of 5 or more fold-change and were enriched in basal cells. These highly expressed genes coded for proteins implicated in cell adhesion, the cytoskeleton, ion transport, and cell signaling. Several genes were also implicated in progenitor functions, suggesting that basal cells may act as stem cells in the epididymis. In other tissues such as prostate or trachea, basal cells can be the origin of other cell types. We demonstrated that basal cells shared some of the features of multipotent stem cells by culturing isolated epididymal basal cells for 14 days. We observed a proliferation and a reorganization of basal cells, as well as modifications in cytokeratins expression.

All the data generated for this thesis show : (1) Epididymal basal cells are not implicated in tricellular junctions. (2) The development of a reproducible method to isolate a highly purified fraction of basal cells. (3) The first gene expression profile of rat epididymal basal cells. (4) The characterization of epididymal basal cells, which suggests that they may possess a progenitor function for epididymal epithelial cells.

Type de document: Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Cyr, Daniel G.
Mots-clés libres: appareil reproducteur mâle ; épididyme ; cellules basales ; barrière hémato-épididymaire ; tricelluline ; isolement cellulaire ; cellules progénitrices; Male reproductive tract ; epididymis ; basal cells ; blood-epididymis barrier ; tricellulin ; cell isolation ; progenitor cells
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 29 avr. 2018 05:19
Dernière modification: 29 avr. 2018 05:19
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/6764

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