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Traduction de la xylanase a chez streptomyces lividans : influence de séquences complémentaires à l’ARNr 16s

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Helal, Ibtissem (2017). Traduction de la xylanase a chez streptomyces lividans : influence de séquences complémentaires à l’ARNr 16s Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en sciences expérimentales de la santé, 121 p.

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Résumé

Pour les applications étendues de Streptomyces lividans et la remarquable exigence du marché, trouver de nouvelles souches de S. lividans capables de produire de la xylanase avec de nouvelles propriétés est devenu un des sujets importants dans la recherche industrielle, bio-alimentaire et environnementale. En particulier, les xylanases revêtent une grande importance pour les industries de bio-blanchiment des pâtes de papier. Ainsi, il nous apparaissait intéressant d’élaborer une souche hyper-productrice de cette enzyme. Certaines études ont montré que la sécrétion de la xylanase A chez S. lividans est nettement améliorée avec le remplacement du peptide signal (ps) de la xln A par celui du long peptide signal de la cellulase A, et ce, grâce à la présence de séquences de 6,7 ou 8 nucléotides que ce ps contient et qui présentent une complémentarité à l’ARNr 16S.

Au cours de ce travail, nous avons émis l’hypothèse que ces séquences d’intérêt de 6 à 8 nt, si elles se retrouvent dans le gène de structure de la xylanase A, elles pourraient influencer la traduction de cette enzyme. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons recherché ces séquences d’intérêt dans le gène de structiure de la XlnA chez S. lividans par alignement de la séquence du gène avec celle de l’ARNr 16S. Nous avons ainsi, localisé 4 séquences de 6 nt chacune, que nous qvons appelé “boîtes”. Celles-ci existent aux positions 181-186, 293-298, 427-432 et 735-740 dans le gène.

Afin d'étudier l’importance de chacune de ces boîtes dans la production de l’enzyme Xln A par S.lividans, nous avons mis au point une méthode de transformation génétique permettant d’optimiser la production de la xylanase A via la mutagenèse dirigée en changeant, une base nucléotidique, dans chacune de ces “boîtes”, par une autre différente tout en conservant l’acide aminé produit. Nous avons ainsi essayé de créer 4 nouveaux mutants de XlnA chez S. lividans par mutagenèse dirigée par PCR en incorporant les boîtes mutées par effet cumulatif. Nous avons réussi à créer 3 nouveaux mutants seulement: pIAF_907.1 ayant la première boîte mutée, pIAF_907.2 ayant les deux premières boîtes mutées et pIAF_907.3 ayant les trois premières boîtes mutées. Le quatrième mutant pIAF_907.4 n’a pas vu le jour, pourtant la mutation de la quatrième boîte a été générée par PCR. Les essaies étaient répétés 3 fois consécutives. Le mutant de S. lividans, pIAF_907.3 présente une performance élevée à la production de l’enzyme xylanase A (1150UI après 144h) en comparaison avec la structure native du clone pIAF_911.A9 (770UI) chez S. lividans.

En effet, grâce à notre étude, nous avons été en mesure de produire plus de 3g/l de xylanase obtenue avec la souche dépourvue des trois séquences de 6 nt complémentaires à l’ARNr 16S. Nous avons observé un effet inverse, alors qu’on s’attendait à une baisse remarquable de la production de la XlnA chez pIAF_907.3, après la destruction de 3 régions de complémentarité avec l’ARNr 16S. La construction du mutant pIAF_907.3 pourvue d’une complémentarité diminuée à l’ARNr 16S stimule, quand même, la production de la xylanase A.

Au cours de ce travail, nous avons montré que la mutation de la première boîte de complémentarité de 6nt à l’ARNr 16S, améliore la production de la xylanase A de 15,7% chez S. lividans. La mutation consécutive dans chacune des deux premières boîtes a entraîné une réduction de 40,26% de l'activité xylanolytique, ce qui montre l'importance de la séquence de la boîte 2 dans Le processus de traduction de Xylanase A dans S. lividans, lorsqu'il est associé à la boîte 3 intacte. D'autre part, la modification des trois premières boîtes a stimulé la production de xylanase de 48,4% en comparaison avec la construction native du gène de la XlnA.

Abstract

For the extensive applications of Streptomyces lividans and the remarkable market demand, finding new strains of S. lividans capable of producing xylanase with new properties has become an important topic in industrial, bio-food and environmental research. In particular, xylanases are of high importance for the bio-bleaching industries of paper pulp. Thus, it appeared interesting to develop a hyper-producing strain of this enzyme. Some studies have shown that the secretion of xylanase A in S. lividans is markedly improved by replacing the Xln A signal peptide (ps) with that of the long ps of cellulase A by the presence of sequences of 6, 7 or 8 nucleotides which this ps contains and which exhibit complementarity to the 16S rRNA.

In this work, we hypothesized that these sequences of interest of 6 to 8 nt, if they occur in the xylanase A structural gene, could influence the translation of this enzyme. To verify this hypothesis, we searched these sequences of interest in the XlnA structural gene in S. lividans by aligning the gene sequence with that of 16S rRNA. We have thus located 4 sequences of 6 nt each, which we call "boxes" which exist at positions 181-186, 293-298, 427-432 and 735-740 in the gene.

In order to study the importance of each of these boxes in the production of the Xln A enzyme by S. lividans, we have developed a genetic transformation method to optimize the production of xylanase A via site-directed mutagenesis by changing, a nucleotide base, in each of these "boxes", to a different one while retaining the produced amino acid. We have thus tried to create 4 new XlnA mutants in S. lividans by PCR-site-directed mutagenesis by incorporating cumulatively mutated boxes. We managed to create 3 new mutants only: pIAF_907.1 having the first mutated box, pIAF_907.2 having the first two mutated boxes and pIAF_907.3 having the first three mutated boxes. Experiements were not successful obtaining the fourth mutant pIAF_907.4, yet the mutation of the fourth box was generated by PCR. The trials were repeated 3 times consecutively. PIAF_907.3 showed high production performance of the xylanase A enzyme (1150 IU after 144 h) in comparison with the native structure of the clone pIAF_911.A9 (770 IU) in S. lividans.

Indeed, thanks to our study, we were able to produce more than 3 g / l of xylanase obtained with pIAF_907.3, strain lacking the three sequences of 6 nt complementary to the 16S rRNA. We observed an inverse effect, whereas a remarkable decrease in the production of XlnA was expected in pIAF_907.3 after the destruction of 3 16S rRNA complementarity sites. The construction of mutant pIAF_907.3 having reduced complementarity to 16S rRNA still stimulates the production of xylanase A.

In this work, we showed that the mutation of the first 6nt complementarity box to 16S rRNA improves the production of xylanase A by 15.7% in S. lividans. The subsequent mutation in each of the first two boxes resulted in a 40.26% reduction in xylanolytic activity, which demonstrates the importance of the box 2 sequence in the Xylanase A translation process in S. lividans. On the other hand, the modification of the first three boxes stimulated xylanase production by 48.4%.

Type de document: Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Lacroix, Monique
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 29 avr. 2018 05:36
Dernière modification: 29 avr. 2018 05:36
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/6690

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