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Caractéristiques et diagnostic de souches du virus de l'encéphalomyocardite associées aux problèmes reproducteurs et respiratoires chez les porcs.

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Canuel, Lucie (1996). Caractéristiques et diagnostic de souches du virus de l'encéphalomyocardite associées aux problèmes reproducteurs et respiratoires chez les porcs. Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 217 p.

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Résumé

Le virus de l'encéphalomyocardite (EMC) appartient au genre Cardiovirus de la famille des Picornaviridae. Cet agent est reconnu comme étant responsable de problèmes de mort subite chez les jeunes porcelets, de même que de problèmes reproducteurs chez les truies de toutes parités en fm de gestation. Le diagnostic d'avortement associé au virus EMC n'est souvent basé que sur la mise en évidence d'anticorps neutralisants de type IgG dans les liquides foetaux, étant donné qu'il y a souvent absence de lésions spécifiques au niveau du myocarde et du cerveau et étant donné les difficultés rencontrées lors de l'isolement du virus en cultures cellulaires.

Les objectifs de ce travail étaient 1) de déterminer les caractéristiques antigéniques et moléculaires de cet agent viral, et 2) d'évaluer la sensibilité et la spécificité des techniques PCR et d'hybridation moléculaire pour la détection du virus dans les tissus de souris et de porcs infectés de façon expérimentale. Des isolats québécois du virus EMC ayant été associés à des épisodes de problèmes reproducteurs et/ou respiratoires chez des truies de toutes parités et des porcelets non-sevrés ont été comparés au cours de ces travaux.

La souche Q.90-890 du virus EMC fut propagée sur culrures cellulaires Vero et purifiée par ultracentrifugation sur gradients de densité de chlorure de césium. L'ARN génomique fut extrait et des copies d'ADNe correspondant aux régions codant pour les protéines structurales VPl et VP4 ont été synthétisées sous l'action de la transcriptase inverse (RT).

Le choix des paires d'amorces oligonucléotidiques utilisées dans les réactions de RT et de polymérisation en chaîne par la Taq polymérase a été fait en se basant sur la séquence d'ADN complémentaire de la souche de référence simienne ATCC VR-129 publiée en 1984. Les produits d'amplification ont été analysés par électrophorèse sur gels d'agarose et des fragments de 410, 434, 461 et 806 paires de base ont été révélés. Des sondes moléculaires, correspondant aux produits amplifiés par la technique PCR et clonés dans un vecteur plasmidique T, ont été synthétisées et marquées à la digoxygénine-11-dUTP, suite à une incubation en présence d'ADN polymérase T7 et d'amorces oligonucléotidiques aléatoires.

La sensibilité de la technique d'amplification enzymatique pour la détection de l' ARN viral dans les cellules Vero infectées fut estimée à 10 4 DCEP50• Une augmentation de cette sensibilité d'un facteur de 10 (10 3 DCEP50) fut obtenue dans les cas où le produit de la réaction PCR était révélé par hybridation à l'aide d'une sonde moléculaire homologue (technique Southern).

La spécificité des fragments génomiques amplifiés a été confirmée par hybridation moléculaire et aucune réactivité n'a été démontrée envers le parvovirus porcin (PPV), le virus de la rhinotrachéite infectieuse bovine (RIB), les entérovirus porcins types 1, 6 et 8 (PEV) et le virus de la diarrhée virale bovine (BVD-MD).

L' ARN génomique de neuf isolats du virus EMC, provenant de fermes québécoises ayant connu une recrudescence de problèmes reproducteurs, de même que trois isolats provenant des États-Unis et de Puerto Rico, a été amplifié en utilisant trois paires d'amorces différentes.

En parallèle, des régions génomiques spécifiques du virus EMC ont été amplifiées par PCR à partir d 'homogénats de tissus de souris infectées de façon expérimentale avec la souche Q.90-890, à des doses de 103 et 104 DCEP50, et prélevés à différents intervalles après le début de l'infection. L'étude de la cinétique d'infection a permis de démontrer la présence du virus au niveau de plusieurs organes vitaux chez la souris tels le cerveau, la rate, le coeur, les poumons et les intestins, confirmant ainsi les résultats obtenus lors d'essais d'isolement en cultures cellulaires. Comparativement, la présence d'antigènes viraux n'a pu être détectée qu'au niveau des intestins et du cerveau après 24 heures par la technique d'immunofluorescence sur coupes de tissus congelés.

La sensibilité de ces différentes techniques a aussi été évaluée pour la détection du virus dans les homogénats d'organes prélevés de porcelets ayant été infectés avec l'isolat Q.90- 890 à une dose de lOS DCEP50• Lors d'analyses histopathologiques, il fut possible de mettre en évidence des lésions de myocardite et d'encéphalite nécrotiques chez les porcelets dès le 4ième jour suivant l'infection. Toutefois, la présence d'antigènes viraux n'a pu être démontrée par immunofluorescence sur coupes de tissus. Lors d'essais d'isolement en cultures cellulaires, le virus fut cultivé à partir d'homogénats de coeur, de poumons, de cerveau et de rate. Les essais effectués avec les techniques PCR et d'hybridation moléculaire ont permis de détecter la présence d'ARN viral dans les homogénats préparés à partir du coeur, du cerveau et de la rate.

La combinaison des techniques PCR et d'hybridation moléculaire s'est donc avérée d 'une sensibilité supérieure aux techniques conventionnelles de détection. De plus, les résultats peuvent être obtenus en moins de 5 jours, comparativement à la période de trois semaines nécessaires à la confrrmation de l'isolement en cultures cellulaires. Ces techniques moléculaires sont très spécifiques et la présence d'anticorps bloqueurs retrouvés normalement dans les tissus d'avortons ou de porcelets immunocompétents n'interfère pas au niveau de leur efficacité.

Au cours de ces travaux, 9 isolats québécois du virus EMC, ayant été associés à des épisodes de problèmes reproducteurs etfou respiratoires et récupérés chez des truies de toutes parités et des porcelets non-sevrés, ont été analysés pour fm de comparaison du point de vue antigénique et génomique afin de vérifier la possibilité de retrouver des variants associés à des tropismes distincts. Dans un premier temps, des épreuves sérologiques ont été effectuées et n'ont permis de révéler aucune variabilité notable entre les divers isolats sauf pour les isolats respiratoire Q. 90-890 et abortif Q. 90-6041, qui ont démontré un titre très inférieur par le test de séroneutralisation ainsi qu'un profil d'immunobuvardage en partie différent de celui obtenu pour les autres isolats porcins québécois. Du point de vue génomique, une analyse des séquences des isolats québécois d'origine respiratoire Q.90-890 et Q. 90-945 a permis de déceler quelques substitutions nucléotidiques se traduisant toutes par des changements au niveau des peptides, pouvant être à la source des variations observées au niveau du tropisme viral.

Type de document: Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Dea, Serge
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 30 avr. 2018 00:28
Dernière modification: 30 avr. 2018 00:28
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/6676

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