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Clonage et expression du gène de la protéase du VIH-1 dans un système bactérien.

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Ochietti, Benoit (1996). Clonage et expression du gène de la protéase du VIH-1 dans un système bactérien. Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 141 p.

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Résumé

La protéase joue un rôle primordial dans la maturation du virus de l'immunodéficience humaine, l'agent étiologique du SIDA. Cette enzyme est impliquée dans le clivage protéolytique des précurseurs polyprotéiques exprimés des gènes GAG et POL du VIH. L'inhibition de la protéase aboutirait à la formation de virions immatures non infectieux, donc incapables de compléter un nouveau cycle réplicatif. Depuis quelques années, notre laboratoire a développé une expertise dans la synthèse d'inhibiteurs spécifiques à la protéase du VIH-1 . De plus, le laboratoire s'intéresse également à l'étude des interactions protéase-inhibiteur par RMN. Cette technique nécessite d'importantes quantités de l'enzyme. Ces études portent également sur des fragments de la protéase. Bien que la protéase du VIH soit disponible commercialement, son coût très élevé justifie la mise au point d'un protocole de production et de purification efficace. De plus, les fragments de l'enzyme ne sont pas disponibles commercialement.

Le vecteur bactérien pET-16b de la compagnie Novagen a été utilisé pour l'expression de la protéase du VIH-1 sous forme de précurseurs polyprotéiques. Le gène de la protéase obtenu du NIH a d'abord été modifié par RPC puis sous-cloné dans le vecteur de propagation p T7T3a 18 et enfin dans le vecteur pET -16b. La forme précurseur comporte une queue d'histidine en position N-terminale permettant sa purification en une seule étape par chromatographie par chélation métallique. L'enzyme a également été purifiée par filtration sur gel Séphadex G-75.

Une des protéases exprimées possède un site d'autoclivage en position Nterminale éliminant la queue d'histidine. L'enzyme sous cette forme a été purifiée par chromatographie d'affinité sur colonne pepstatine A-agarose. Ces différentes méthodes ont permis l'obtention de protéases partiellement purifiées. Par contre, les constructions pour les deux fragments de la protéase seront à préparer de nouveau à cause de problèmes avec les amorces utilisées pour l'amplification des séquences correspondantes.

Ce projet de recherche met en évidence l'efficacité de la technique de RPC combinée au clonage dans un vecteur multifonctionnel de type pT7T3a18. Par ailleurs, nos résultats soulignent les difficultés reliées à l'expression et à la purification d'une protéine toxique dans un système bactérien, et montrent l'importance du choix du vecteur d'expression et de la souche bactérienne dans de telles conditions.

Type de document: Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Sauvé, Gilles
Co-directeurs de mémoire/thèse: Yelle, Jocelyn
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 30 avr. 2018 00:31
Dernière modification: 30 avr. 2018 00:31
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/6671

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