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Mise au point et contrôle de la qualité de la réaction de polymérisation en chaîne (PCR) appliquée au diagnostic de parvovirus porcins (PPV)

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Dubuc, Roger (1996). Mise au point et contrôle de la qualité de la réaction de polymérisation en chaîne (PCR) appliquée au diagnostic de parvovirus porcins (PPV) Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 267 p.

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Résumé

Ce projet de maîtrise visait deux objectifs principaux. Premièrement, doter le Service de diagnostic virologique vétérinaire de l'Institut Armand-Frappier, subventionné par le Ministère de l'Agriculture, Pêcheries et Alimentation du Québec (MAP AQ), d'une méthode d'analyse permettant de distinguer les souches pathogènes (virulentes) et non pathogènes (vaccinales) de parvovirus porcin (PPV). L'approche envisagée était basée sur la biologie moléculaire du virus et impliquait l'utilisation de la réaction de polymérisation en chaîne (PCR). Cette utilisation de la PCR comme instrument de diagnostic établissait le deuxième objectif de la recherche: évaluer les possibilités et les limites de cette nouvelle technologie en fonction du Service et surtout, définir une stratégie pouvant en assurer le contrôle de qualité.

Mettant à profit l'identification des déterminants allotropiques de différentes souches de PPV (Bergeron et al., 1996), nous avons développé une méthode de PCR discriminant les souches pathogènes et non pathogènes de ce virus. Dans cette optique, deux paires d'amorces sont utilisées à l'intérieur d'un même cocktail d'amplification; de telle sorte qu'alternativement deux amplicons de longueurs différentes (révélateurs de la souche de PPV) de même qu'un amplicon commun (indicatif de la présence de PP V) sont générés. Dans chaque combinaison, une seule des deux amorces est spécifique à la souche, et ce, grâce aux deux derniers nucléotides utilisés en 3'. De cette manière, nous avons entre autre identifié de façon non équivoque un PPV de type virulent isolé de l'intestin d'un porc diarrhéique.

Durant la mise au point de cette technique, nous avons rencontré des problèmes de reproductibilité de la PCR, ce qui nous a amené à entreprendre une étude de stabilité de l'ADN plasmidique de même qu'à tenter de cerner le rôle d'éventuels inhibiteurs de la réaction de polymérisation en chaîne. Quoique difficilement identifiables, ces inhibiteurs ont pu être transférés d'un tube à l'autre. À l'inverse, nous avons aussi rencontré des problèmes de contamination moléculaire générant de faux résultats positifs en PCR.

Afin détablir une philosophie de contrôle de qualité, nous avons privilégié une approche quantitative de la PCR. Nous avons mis au point une réaction de PCR classique où l'amplicon de PPV généré contient naturellement un site de restriction EcoRI. À partir d'un plasmide contenant le génome entier et infectieux du PPVNADL2 (Bergeron etal., 1993), nous avons, par mutagénèse dirigée, créé un génome PPV mutant où le site Eco RI est transformé en site de restriction BamHI. Ce gabarit sert de standard interne dans la réaction de PCR classique et une seule paire d'amorces amplifie indistinctement et avec la même efficacité les PPV sauvage et mutant.

Une des amorces étant biotinylée en 5', il devient possible de capturer les amplicons sur une micro-plaque enrobée de streptavidine. Après dénaturation alcaline, les ADN monocaténaires capturés sont hybridés, en aval du site de restriction, à une courte sonde dont l'extrémité 3' est marquée à la digoxigénine. Chaque échantillon occupe au moins trois cupules. La première cupule, intacte, n'est pas soumise aux enzymes de restriction et représente la quantité totale d'amplicons. Les deuxième et troisième cupules sont respectivement soumises à la digestion enzymatique de Eco RI et de Bamffi. La coupure EcoRI élimine le signal généré par le PPV sauvage, mais n'affecte pas celui du standard interne. La coupure Bamlll élimine le signal généré par le standard interne, mais n'affecte pas celui du PPV sauvage.

Subséquemment à la digestion enzymatique, un anticorps anti-Dig, conjugué à la peroxydase, sert de révélateur par son action sur le substrat (TMB:H20 2) et la coloration produite est lue au spectrophotomètre. De cette façon, la performance globale du système est évaluée grâce à la somme des absorbances, obtenues avec les cupules soumises aux enzymes de restriction, qui doit égaler l'absorbance de la cupule intacte. De plus, un signal absent ou trop faible de la part du standard interne permet d'éliminer les éventuels faux négatifs. L'ajout d'échantillons ne contenant pas d'ADN sert de contrôle pour les faux positifs.

Les essais préliminaires ayant porté sur des constructions de laboratoire, nous nous sommes ensuite tournés vers les échantillons cliniques. Une centaine de cas, la plupart étant des foetus de porc déjà analysés selon les méthodes conventionnelles de diagnostic vétérinaire, a servi de matériel de base. Plusieurs méthodes d'extraction du PPV ont été essayées. Finalement, une procédure utilisant la protéinase K additionnée directement au tampon de PCR a été retenue. Nous avons également tenté de transfecter des cellules eucaryotes avec l'ADN plasmidique du PPV mutant et théoriquement infectieux. Cette démarche visait à générer un véritable virus modifié pouvant servir non seulement de standard interne en PCR, mais aussi de contrôle d'efficacité de l'extraction du PPV des échantillons cliniques. Malheureusement, toutes les tentatives sont demeurées vaines.

Sur 119 cas analysés par PCR différentielle, sept ont été trouvés positifs au PPV; exactement comme l'isolement par passages sur cultures cellulaires, mais nettement moins que l'immunofluorescence sur coupes de tissus qui déclarait 56% des échantillons infectés de PPV. Les sept cas positifs présentaient tous un profil de PPV pathogène. L'analyse d'une trentaine de spécimens par PCR quantitative s'est révélée beaucoup plus problématique. La présence occasionnelle d'hétéroduplex, mais surtout un manque de cohérence au niveau des digestions enzymatiques, exigeraient une poursuite de la recherche.

Type de document: Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Tijssen, Peter
Co-directeurs de mémoire/thèse: Marsolais, Grégoire
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 30 avr. 2018 00:34
Dernière modification: 30 avr. 2018 00:34
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/6670

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