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Les protéines du virus grippal activent la protéine kinase c des leucocytes polymorphonucléaires humains.

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Gasse, Nancy (1996). Les protéines du virus grippal activent la protéine kinase c des leucocytes polymorphonucléaires humains. Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 178 p.

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Résumé

Le virus influenza active les leucocytes polymorphonucléaires (PMNL). Ces cellules jouent un rôle important dans la défense précoce contre le virus grippal et dans la guérison de l'hôte. Des évidences récentes indiquent que la phosphorylation de protéines, via la protéine kinase C (PKC), est un procédé majeur dans l'activation des PMNL. La PKC est une enzyme membranaire qui joue un rôle crucial dans la transduction de signaux qui peuvent mener à des réponses immunitaires ou à des mécanismes de défense. Nous avons donc étudié l'effet des protéines du virus grippal sur l'activité PKC des PMNL humains.

Les PMNL ont été isolés du sang provenant de donneurs volontaires. Ils ont été incubés en présence du virus influenza de type A et des protéines virales purifiées, soit l'hémagglutinine (HA), la neuraminidase (NA) et la protéine matricielle (M). Les cellules stimulées ont par la suite été incorporées à un milieu réactionnel et l'activité PKC (pmol/2x1 05 cellules/min) a été mesurée en quantifiant l'incorporation de phosphates radioactifs dans un substrat synthétique spécifique à l'enzyme.

Le virus influenza (67,4 ± 3,8) augmentent de façon significative l'activité PKC des PMNL humains, par rapport aux cellules non stimulées (20,3 ± 0,9). Les composantes virales, responsables de cette élévation d'activité PKC, ont été identifiées. Une augmentation significative est observée chez les PMNL incubés en présence de 0,25 1-1g des protéines virales purifiées, soit la HA dépourvue de sont activité hémagglutinante (80,0 ± 7,6), la NA sans activité enzymatique (83,6 ± 9,0) et la protéine M (86,2 ± 9,0). Les oligosaccharides présents sur la HA et la NA ne paraissent pas jouer de rôle critique dans l'activation de la PKC puisque la protéine M, qui est non glycosylée, a un potentiel d'activation similaire à celui des glycoprotéines. De plus, l'activation de la PKC est indépendante de l'activité hémagglutinante de la HA et de l'activité enzymatique de la NA car les glycoprotéines dotées de leur activité biologique ont un potentiel d'activation similaire à celui des glycoprotéines dépourvues de leur activité biologique.

Les résultats démontrent que l'augmentation d'activité PKC observée est spécifique aux protéines virales. Cette assertion se base selon les observations suivantes. D'abord, l'albumine sérique bovine (23,0 ± 1,2), qui a été utilisée à titre de témoin ne provoque pas d'augmentation d'activité PKC significative par rapport au PMNL non stimulés (20,3 ± 0,9). De plus, l'activité PKC induite par les glycoprotéines est inhibée par la présence d'anticorps anti-NA/HA. Les cellules qui ont été traitées avec le complexe virus (5 1-19)-anticorps (1 0 1-19) montrent une diminution d'activité de 47% par rapport aux cellules incubées avec le virus seul et des diminutions de 58% et 65% ont été observées chez les PMNL incubés avec les complexes HA (0,25 J.Jg)-anticorps (1 0 J.Jg) et NA (0,25 ~g)-anticorps {1 0 J.Jg) respectivement.

Les résultats démontrent également que la PKC est responsable de l'augmentation d'activité observée. D'abord, la translocation qui est un index de l'activation enzymatique a été observée. Chez les PMNL non stimulées l'activité PKC se situe au niveau du cytosol et une stimulation avec la HA et la NA provoque une baisse d'activité cytosolique qui s'est trouvée cinq fois moins élevée après 30 min de stimulation. Quant à J'activité membranaire, elle s'est trouvée quatre fois plus élevée. La translocation s'est également produite chez les cellules stimulées par Je virus purifié. L'activité membranaire a augmenté environ quatre fois après 30 min de stimulation parallèlement à une diminution de l'activité cytosolique du même ordre. Deuxièmement, un inhibiteur spécifique à J'enzyme a été incorporé dans le milieu réactionnel. Les résultats démontrent que la présence de 50 J,JM d'inhibiteur provoque une chute d'activité de plus de 90%. Troisièmement, les résultats indiquent que les isoformes a et/ou ~ de la famille des PKC conventionnelles (cPKC) ont été activés car l'absence de calcium dans le milieu réactionnel a provoqué une diminution d'activité de plus de 80% chez les cellules stimulées par le virus et les glycoprotéines. Enfin, la phosphorylation d'un substrat spécifique permettant la détection sélective des cPKC confirme ces résultats.

Le ou les mécanismes impliqués dans l'activation de la PKC par les protéines virales restent à déterminer. Toutefois, les résultats suggèrent l'implication d'un site cellulaire. Les études de compétition indiquent que la HA et la NA ciblent le même site cellulaire et ce dernier est évidemment différent de celui utilisé par le PMA. Les PMNL traités par la HA (0,25 ~g) et subséquemment stimulés avec le PMA (1 ~M) montrent une augmentation d'activité PKC (134,5 ± 1.8) près de deux fois supérieure par rapport à l'activité PKC des PMNL stimulés par HA seulement (75,8 ± 2,5). Quant aux cellules traitées par HA et subséquemment stimulées par la NA (74,7 ± 2,3), elles ne montrent aucune différence significative par rapport aux cellules stimulées par HA seulement. Les observations sont similaires chez les cellules qui ont d'abord été traitées par la NA. Enfin, si un site cellulaire est impliqué dans l'activation de la PKC par les protéines virales, ce dernier est différent du site d'attachement de la HA puisque la HA dotée de son activité hémagglutinante provoque une activation PKC similaire à celle de la HA dépourvue d'activité hémagglutinante.

Dans leur ensemble, nos résultats montrent le potentiel des protéines virales purifiées pour stimuler l'activité de la PKC. L'activation de cette enzyme pourrait être particulièrement intéressante étant donné le rôle clé qu'elle joue dans l'induction de réponses immunitaires et de mécanismes de défense qui contribuent à la défense contre une infection grippale.

Type de document: Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Arora, Jit
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 29 avr. 2018 05:49
Dernière modification: 29 avr. 2018 05:49
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/6661

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