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Étude de l'enzyme de conversion de l'endothéline et synthèse de fragments de la Big endothéline

Carette, Julie (1996). Étude de l'enzyme de conversion de l'endothéline et synthèse de fragments de la Big endothéline Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en sciences expérimentales de la santé, 119 p.

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Résumé

L'endothéline est un peptide de 21 acides aminés, principalement impliqué dans le contrôle de la pression sanguine. Elle est un des facteurs proposés pour engendrer l'hypertension et les vasospasmes. La formation de l'endothéline est médiée par l'action de l'enzyme de conversion de l'endothéline (ECE) sur la Big-en:dothéline (Big-ET). Ainsi la ECE clive le lien Trp21 - Va122 de la Big-endothéline pour libérer l'endothéline mature. Au niveau vasculaire, la Big-endothéline est 100 fois moins active que l'endothéline. ·Il a été déterminé que l'enzyme de conversion de l'endothéline est une métalloprotéase sensible au phosphoramidon. Notre étude tente donc d'élucider certains aspects moléculaires du mécanisme d'action de cette ECE. Pour ce faire, nous devons commencer par détenniner le plus court substrat pouvant être clivé par l'enzyme de conversion.

La synthèse de la Big-endothéline-1 a été réalisée sur phase solide selon une méthodologie assurant, entre autres, la stabilité chinùque du tryptophane-21 . Les travaux ont permis de démontrer que le clivage à l'acide fluorhydrique est plus efficace que celui au tri.fluorométhanesulfonate de triméthylsilyle (fMSOTf), pour ce qui est de la Big-endothéline. Les purifications ont été réalisées sur un système HPLC préparatif avec un gradient d'acétonitrile. Le peptide linéaire a ensuite été cyclisé, premièrement au K3Fe(CN)6 pour le pont disulfure entre les résidus 3 et 11 et deuxièmement à l'iode, pour les résidus 1 et 15. Le peptide a subi une étape finale de déformylation du tryptophane-21 afin d'obtenir une Bigendothéline équivalente à celle d'origine naturelle.

Les analyses de la transformation enzymatique de la Big-endothéline synthétique ont été exécutées au moyen de la ECE extraite de poumon de boeuf et purifiée par centrifugations différentielles. Les conditions de cinétique enzymatique ont aussi été déterminées. Les cinétiques réalisées à 3 7 °C ont toutes donné les mêmes profils. Ains~ nous avons observé dès le temps initial ( t = 0 ) une transformation d'environ 50% de la Big-endothéline. Ce niveau reste ensuite constant. Deux explications ont été avancées pour expliquer ce phénomène ~temps initial. Premièrement, il a été soupçonné que l'endothéline observée au niveau des membranes était d'origine endogène et non issue de la transformation de la BigET. Deuxièmement, nous avons aussi évalué la possibilité que le clivage enzymatique s'effectuerait extrêmement rapidement de sorte que l'évolution de la production de ET -1 ne pourrait être mesurée adéquatement avec ~méthodologie retenue. La présence d'endothéline endogène a donc été testée. Ainsi, l'utilisation de phosphoranûdon; principal inhibiteur de l'enzyme de conversion de l'endothéline, a permis d'élinûner cette hypothèse car nous n'observons pas de présence de ET -1 . Ce qui a aussi été confinné par une cinétique à 4 °C. Donc nous avons conclu que la réaction à 3 7°C était instantanée et que notre enzyme était active. L'arrêt de la réaction pour atteindre un plateau de Big-ET-1 restant (50%) peut s'expliquer par un manque ou un~ diminution d'un ou plusieurs co-facteurs qui seraient · nécessaire à la réaction complète. On sait déjà que le zinc serait impliqué dans la liaison de la Big-ET-1 à l'enzyme mais d'autres co-facteurs pourraient aussi être nécessaires au processus de clivage. Une rétroinhibition par l'ET -1 produite peut aussi être envisag~ pour expliquer le phénomène. Dans la rétroinJùbition, l'accumulation de produit final diminue ou arrête l'activité de l'enzyme.

Nous avons donc poursuivi avec la synthèse des fragments de la Big-ET-1 selon la méthode'pr~ente. D'autres études d~~~ni être entreprises pour déterminer lequel de ces fragmeil~ est recormu par ECE. D sera alors possible de remplace,r le lien Trp21 - Vai22 par un lien pseudopeptidique non scissile par l'enzyme. Ultimement, le peptide sera évalué pour ses pouvoirs inhibiteurs sur ECE.

Type de document: Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Fournier, Alain
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 25 oct. 2017 14:40
Dernière modification: 25 oct. 2017 14:40
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/6311

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