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Structure et fonction de la partie unique da la protéine VP1 du parvovirus porcin.

Bouchard-Lévesque, Véronique (2011). Structure et fonction de la partie unique da la protéine VP1 du parvovirus porcin. Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Doctorat en virologie et immunologie, 164 p.

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Résumé

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Le parvovirus porcin (PPV) possède une capside de symétrie icosahédrale, avec une lattice de triangulation (T) égale à un, formée des protéines VP1 (84 kDa) et VP2 (64 kDa). La séquence de VP1 est identique à celle de VP2 à l'exception d'une extension de 150 acides aminés (aa) en N-terminal. Cette partie unique de VP1 (VP1up) est cruciale pour l'infectivité, notamment en raison de la présence d'un motif phospholipase A2 (pvPLA2) assurant une fonction capitale dans les étapes précoces du cycle viral. En raison de l'importance de la pvPLA2 dans le cycle viral et de l'existence de nombreuses différences la distinguant des PLA2 sécrétées (sPLA2), nous souhaitions obtenir sa structure tridimensionnelle par résonance magnétique nucléaire (RMN). Cette technique s'imposait puisque notre laboratoire a été incapable antérieurement de visualiser VP1up par cristallographie. Au préalable, étant donné la toxicité de VP1up conférée par l'activité pvPLA2, nous avons dû optimiser son expression et sa purification. Nous avons obtenu des taux de pureté et des rendements de production de VP1up excellents, 99% et 4 mg de protéine purifiée/litre de culture respectivement. Toutefois, les essais de RMN ont été infructueux. L'instabilité de cette région, due à l'absence de ponts disulfures, pourrait expliquer les difficultés encourues. Ainsi, l'insertion de cystéines, dans des endroits stratégiques pourrait possiblement faciliter l'élucidation de la structure de ce domaine enzymatique. Aussi, VP1up possède cinq régions basiques correspondant potentiellement à des signaux de localisation nucléaire (NLS), ici appelées BR1 (aa 3 à 9), BR2 (aa 86 à 89), BR3 (aa 110 à 116), BR4 (aa 120 à 130) et BR5 (aa 137 à 141), pouvant également contribuer à son importance dans l'infectivité. Ces régions pourraient être essentielles pour la translocation nucléaire précoce de la capside et tardive des trimères de VP1NP2. Des protéines recombinantes contenant VP1up dépourvue de son activité pvPLA2 (mutant HO-) fusionnée à la protéine fluorescente mCherry ont été générées dans un vecteur d'expression. Puis, des expériences de mutagenèse dirigée dans les BRs et de microscopie à fluorescence ont permis de démontrer que les BR4 et BR5 forment un NLS bipartite et que VP1up possède deux NLSs fonctionnels majeurs, BR1 et BR4- BR5. Les mutations BR1 et BR1/BR4/BR5 ont été transférées dans un clone infectieux du PPV afin de mieux comprendre les rôles de ces NLSs dans le cycle viral. Leur importance dans l'infectivité et dans les étapes tardives d'infection a été évaluée grâce à des titrages et par PCR quantitatif, respectivement. Ces résultats révèlent qu'ils sont cruciaux pour les étapes précoces du cycle viral. Finalement, nous avons démontré que VP1up se localise naturellement à l'intérieur du nucléole. Aussi, nous avons débuté la détermination des rôles des BRs dans sa localisation nucléolaire et d'interactions VP1up-protéines nucléolaires. Les résultats préliminaires suggèrent fortement que certaines BRs possèdent une activité de transport nucléolaire et que VP1up interagit avec la protéine nucléophosmine/823 via la BR4. L'importance des interactions entre le virus et le nucléole reste à déterminer. En conclusion, ces expériences ont mis en lumière les fonctions multiples de VP1 et permettront une meilleure compréhension de ses rôles dans l'infection.

Type de document: Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Tijssen, Peter
Informations complémentaires: Résumé avec symboles
Mots-clés libres: porc
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 30 nov. 2015 19:39
Dernière modification: 30 nov. 2015 19:39
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/576

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