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Le rôle d’UL24 dans la régulation génique de la protéine R1 de la ribonucléotide réductase du virus de l’Herpès Simplex de type 1.

Sanabria Solano, Carolina (2012). Le rôle d’UL24 dans la régulation génique de la protéine R1 de la ribonucléotide réductase du virus de l’Herpès Simplex de type 1. Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 72 p.

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Résumé

Le virus de l’herpès simplex de type 1 (HSV-1) est un virus neurotrope qui affecte environ 80 % de la population mondiale. Il peut causer des feux sauvages, des kératites et parfois des encéphalites virales. Chez des patients immunosuprimés et les nouveau-nés, la maladie est souvent très sévère. Le gène codant pour la protéine virale UL24 est conservé parmi tous les Herpesviridae. Cette protéine possède des domaines d’homologie hautement conservés dans sa partie N-terminale. En culture cellulaire, un virus déficient en UL24 (UL24X) démontre une diminution des titres viraux dans les cellules Vero et HeLa, entre autres. In vivo, il y a une diminution drastique des titres viraux dans les ganglions trigéminaux (TG) ainsi qu’une réduction sévère de l’efficacité de réactivation virale à partir de la latence. UL24 est donc un déterminant de la pathogenèse virale. Des études sur l’orthologue d´UL24, UL76 du cytomégalovirus humain, ont montré une fonction de régulation génique de cette protéine mais les mécanismes impliqués sont méconnus. Des résultats préliminaires du laboratoire ont suggéré que dans un contexte de transfection, l’expression d’UL24 corrélait avec une réduction de l’expression de la grande sous-unité de la Ribonucléotide Réductase virale (R1). Cette protéine est impliquée dans la synthèse d’ADN viral en réduisant les ribonucléotides en deoxyribonucléotides (dNTP). Notre hypothèse était qu’UL24 régule les niveaux de la protéine R1 en intervenant à divers stades de l’expression génique. Nous avons démontré en contexte de co-transfection que l’expression de la protéine virale UL24 inhibe l´expression de la protéine R1. L’effet d’UL24 sur la protéine GST-R1 semble dépendre seulement de la partie R1 ; l’inhibition a été observée dans les cellules humaines (293T) et des cellules de singe (COS-7). Par ailleurs, à l’aide d’immunobuvardage de type Western nous avons montré que ce phénomène était dépendant de la dose de plasmide exprimant UL24. Des expériences de transfection utilisant des versions mutantes d’UL24 portant des substitutions des résidus hautement conservés (E99, K101 et G121), particulièrement dans le domaine putatif d’endonucléase PD-(D/E)-XK, ont montré un rétablissement de l’expression de R1. Ainsi, on a observé que ces résidus et possiblement le domaine d’endonucléase sont importants pour la diminution de l’expression de R1 en présence d’UL24. Par ailleurs ces résultats suggèrent que c’est la protéine et non le transcrit d’UL24 qui est responsable de cette fonction. Par qRT-PCR, nous avons observé en présence de la protéine virale UL24 une diminution de cinquante pourcent de la quantité de transcrits de R1 en contexte de co-transfection comparativement aux niveaux obtenus avec un vecteur vide. Quoique, ces résultats n’expliqueraient pas la très grande diminution des niveaux de R1 où la protéine n’est souvent plus détectée en présenced'HA-UL24. Par ailleurs, nous avons démontré que la diminution de la quantité de R1 était indépendante de la dégradation protéique via le protéasome ainsi que via le lysosome. Ces résultats dévoilent un impact d'UL24 de HSV-1 au niveau de la régulation génique.__________________ABSTRACT________________ Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is neurotropic and affects almost 80% of the world population. It can cause skin lesions known as cold sores, viral keratitis and sometimes viral encephalitis. Among immunosuppressed patients and newborns, the disease is often more severe. The gene that codes for the viral protein UL24 is conserved among all herpesviridae. The N-terminal part of this protein has homology domains that are highly conserved. In cell culture, a virus deficient for UL24 (UL24X) exhibits a reduction in viral titers following viral replication on Vero and Hela cells. UL24 is thus considered to be a determinant of viral pathogenesis. In vivo, viral titers are drastically decreased in the trigeminal ganglia (TG); the efficiency of the reactivation from latency is highly reduced as well. Studies of the UL76 protein of human cytomegalovirus, an ortholog of UL24, showed that this protein is involved in the regulation of gene expression; however, the mechanisms involved are still unknown. In our laboratory, preliminary results suggested that in transient transfection experiment, the expression of UL24 correlated with a reduction of the expression of R1 and the large subunit of the ribonucleotide reductase enzyme (R1) by transfection. This protein promotes viral DNA synthesis by reducing ribonucleotides to deoxyribonucleotides (dNTP). Our hypothesis was that UL24 is important in the regulation of the protein R1 at different levels. In co-transfection and Western blotting experiments, we discovered that the expression of the protein UL24 inhibits expression of the protein R1. Furthermore, we showed that the inhibition was specific and independent of the GST tag of the R1 protein both in human and monkey cells (293T and COS- 7 respectively). Moreover, the observed effect of UL24 was dose-dependent. An assay testing variants of UL24 that contain substitutions of highly conserved residues some involved in the UL24 PD-(D/E)-XK endonuclease domain (E99A, K101A), and some not (G121A), revealed diminished the inhibition of R1 expression. Therefore, these residues seem to be important for the reduction of the expression of R1 in the presence of UL24. Furthermore, these results suggest that it is the protein UL24 and not its transcripts that is important for the observed effect. We found, by qRT-PCR, that in the presence of UL24, the amount of R1 transcripts were reduced by 50% compared to the levels found in the absence of UL24. Interesting, this reduction alone cannot explain the drastic reduction in levels of R1 protein, often below the limits of detection observed in the presence of UL24. Finally, we found that the reduction observed does not involve the degradation of R1 protein by the proteasome or the lysosome degradation pathways. These results reveal a role for UL24 of HSV-1 in gene regulation.

Type de document: Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Pearson, Angela
Co-directeurs de mémoire/thèse: Langelier, Y. (CRCHUM)
Mots-clés libres: hsv
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 28 mars 2017 19:33
Dernière modification: 28 mars 2017 19:33
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/520

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