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ETUDE DE L'EVOLUTION DE LA DIVERSITE MICROBIENNE LORS DU PROCESSUS D'ACTIVATION D'UN SOL POUR LA BIODÉGRADATION DU PENTACHLOROPHÉNOL

Beaulieu, Maude (2000). ETUDE DE L'EVOLUTION DE LA DIVERSITE MICROBIENNE LORS DU PROCESSUS D'ACTIVATION D'UN SOL POUR LA BIODÉGRADATION DU PENTACHLOROPHÉNOL Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 133 p.

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Résumé

Un sol légèrement contaminé au pentachlorophénol (2,3 mg/kg de sol) a été utilisé pour la production de deux types de sols activés en phase boueuse (soVeau: 10 % poids/volume) en bioréacteurs de 10 litres. Le premier bioréateur a été activé à l'aide d'une solution alcaline de PCP et le bioréacteur #2 a été activé à l'aide d'un mélange de PCP dissous dans une solution de préservation du bois. Cette technique a permis le développement rapide et spécifique d'une biomasse performante pour la biodégradation du PCP. En effet, la dégradation du PCP a été supérieure à 99% et des taux moyens de dégradation de 21 et 22 mg/1 par jour ont été atteint pour les réacteurs #1 et #2 respectivement. Les taux de dégradation maximaux sont passés de 19 à 132 mg/1 par jour pour le réacteur #1 et de 41 à 112 mg/1 par jour pour le réacteur #2.

Le présent travail a porté sur 1' étude de 1' évolution de la diversité microbienne lors de l'établissement du processus d'activation du sol. Tout d'abord, les gènes pcpB, codant pour la PCP-4-monooxygénase, ont été détectés et suivis dans les bioréacteurs grâce à l'utilisation du PCR en présence d'amorces spécifiques à ces gènes. Cela a permis de constater l'apparition d'un signal témoignant de la présence de ceux-ci dès le 13ïème jour du processus d'activation et ce pour les deux biorécteurs. Les gènes pcpB ont aussi été quantifiés. La technique du PCR compétitif a été utilisée et a permis de déduire le nombre de copie de ces gènes dans les échantillons analysés. Les bioréacteurs # 1 et #2 contenaient 4,5 x 106 gènes pcpB par ml et 12 x 106 gènes pcpB par ml aux jours 40 et 31 respectivement.

Une génothèque des gènes pcpB a été construite et plus d'une centaine de clones ont été criblés. Pannis ceux-ci, 16 clones ont été sélectionnés et leur gène pcpB séquencé; puis, une analyse phylogénétique a été réalisée. Les séquences des gènes pcpB de 12 de ces clones étaient très similaires à la séquence du gène pcpB de la souche Sphingomonas sp. UG30; alors que les 4 autres séquences étaient similaires aux séquences des gènes pcpB des souches S. jlava et S. chlorophenolica. Ces trois microorganismes sont reconnus pour leur capacité de biodégradation du pentachlorophénol. L'analyse phylogénétique a permis de découvrir un groupe de trois séquences des gènes pcpB très éloignées génétiquement des bactéries de référence ci-haut mentionnées.

Le suivi de la microflore totale a été effectué via 1 'utilisation du PCR en présence d'amorces universelles pour les gènes de l'ARN 16S ribosomal des eubactéries. La méthode SSCP a été employée pour visualiser l'évolution de la diversité microbienne dans les bioréacteurs pendant les 80 jours du processus d'activation du sol. Dans le cas du bioréateur #1, cette technique a réussi à démontrer visuellement des changements dans la microflore, à savoir une diminution de la diversité totale occasionnée par le développement spécifique d'une biomasse particulière dégradant le PCP. Dans le cas du bioréacteurs #2, la diversité est restée beaucoup plus complexe.

Une génothèque des gènes de l' ARN 16S ribosomal a été construite et plusieurs centaines de clones ont été criblés. En tout, 14 clones ont été sélectionnés et leurs gènes séquencés. Les séquences des gènes ont été regoupées en trois catégories: 1) 5 séquences étaient similaires aux séquences des gènes de 1' ARNr 16S de bactéries provenants d'échantillons de l'environnement; 2) 6 séquences étaient similaires aux séquence des gènes de l'ARNr 16S de bactéries de la famille des a.-Proteobacteria; et 3) 3 séquences étaient similaires aux séquences des gènes de l'ARNr 16S de bactéries de la famille des Cytophagales.

Abstract

Two activated soils were generated in a previous work (Becaert et al., 2000), one acclimated with PCP and the second with a wood preservative mixture (WPM) containing severa! pollutants such as PCP, petroleum hydrocarbons and polychlorinated dioxins and furans. The impact of these compounds on the microbial diversity was studied using molecular approaches. PCR amplification of the 168 rDNA gene sequences was carried out with total DNA extracted from soil samples taken at different time during the acclimation process of each reactor. The composition of these PCR products, reflecting the microbial diversity, was monitored by the single-strand-conformation polymorphism (88CP) method. Our results showed that the complexity of the 88CP patterns in the PCP reactor decreased significantly during the activation process whereas they remained complex in the WPM reactor. Cloning and sequencing of the 168 PCR products followed by a phylogenic analysis revealed that, in the PCP reactor, most of the clones were related to the genus Sphingomonas. These results showed that the activation with PCP resulted in a selection of few microorganisms. Furthermore, Bécaert et al. (2000) also showed the appearance by PCR of pcpB sequence, encoding for the PCP-4-monooxygenase in Sphingomonas bacteria, during the activation process in both reactors. Cloning and sequencing of PCR amplified pcpB sequences revealed that most of the clones were related to Sphingomonas sp. strain UG30 pcpB. However, three pcpB clones were not closely related to the three known Sphingomonas pcpB genes.

Type de document: Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Villemur, Richard
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 24 mars 2017 13:54
Dernière modification: 24 mars 2017 13:54
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/4932

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