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Purification et caractérisation d'une estérase produite par Enterobacter cloacae hydrolysant les parabènes.

Dupont, Maryse (2000). Purification et caractérisation d'une estérase produite par Enterobacter cloacae hydrolysant les parabènes. Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 90 p.

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Résumé

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Des travaux de purification et de caractérisation d'une enzyme produite par Enterobacter cloacae hydrolysant les parabènes ont été entrepris afm de mieux comprendre les mécanismes de résistance des microorganismes face aux parabènes. L'enzyme a été purifiée par chromatographie liquide à haute pression à l'aide de 4 colonnes chromatographiques. La première fut une colonne cationique (CM Ap-2, Waters), la seconde une colonne anionique (QMA, Waters), la troisième une colonne cationique ayant des propriétés différentes à la première (CM Avicell, Waters) et la dernière était un tamis moléculaire (Protein-Pack SW 300). Les rendements obtenus lors de ces étapes de purification furent respectivement de 69.8 %, 48.7 %, 17.3% et 15.9% et les taux de purification par rapport à la fraction initiale furent de 37.8, 67.6, 500 et 572.9 respectivement.

La purification a permis la détermination du poids moléculaire de l'enzyme qui a tout d'abord été évalué à 55 000 Da par visualisation sur SDS-Page. Ensuite, le poids moléculaire fut mesuré à 54 640 Da par spectrométrie de masse. Le point isoélectrique fut également évalué à 6.9 par gel d'isofocalisation électrique.

Suite à la purification de l'enzyme des travaux de séquençage ont été entrepris. Lors de ces travaux, une séquence de 19 acides aminés correspondant à 1' extrémité N-terminale fut déterminée (Gln-Glu-Leu-Ser-Pro-Val-Gln-Met-Ser-Lys-Gly-ThrIle- Glu-Gly-Val-Lys-Asn-Asp). Une deuxième séquence interne fut déterminée par spectrométrie de masse (Val-Ala-Pro-Thr-Glu). Une troisième séquence interne fut déterminée par le séquençage d'un fragment obtenu par traitement de l'enzyme au bromure de cyanogène (Ala-Gly-Tyr-Phe-Ala-Lys-Gly-Leu-Phe-Asn-Arg-Ala-IleVal- Ser-Lys-Gly-Tyr). A partir de ces séquences, des oligonucléotides dégénérés furent produits et plusieurs PCR furent effectués dans diverses contitions. Trois produits d'amplification ont été clonés et séquençés. Cependant, aucun d'entre eux ne correspondait à 1' estérase recherchée. Le premier gène correspondait à une protéine de régulation (glycosyl-3-phosphate), le deuxième codait pour une perméase (glycerol-3-phosphate) et le troisième codait pour une aminotransférase. Un alignement de séquence fait à partir de la séquence obtenue par traitement au bromure de cyanogène démontre une homologie avec 11 carboxylestérases connues. Ceci laisse croire que l'enzyme purifiée en serait une carboxylestérase.

Un test d'inhibition au diisopropyl fluorophosphate (DFP) a été effectué. Le test a démontré une inhibition complète de l'activité enzymatique ce qui indique que l'estérase possède une sérine active au site catalytique.

Type de document: Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Lépine, François
Informations complémentaires: Résumé avec symboles
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 27 mars 2017 15:40
Dernière modification: 27 mars 2017 15:40
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/4923

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