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Évaluation de méthodes de phosphorylation, de sulfatation et de cyclisation de l'endothéline-1

Létourneau, Myriam (1999). Évaluation de méthodes de phosphorylation, de sulfatation et de cyclisation de l'endothéline-1 Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en sciences expérimentales de la santé, 62 p.

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Résumé

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Les endothélines forment une famille d'isopeptides vasoactifs caractérisés par une chaîne de 21 acides aminés dont les extrémités amino et carboxy-terminales sont libres et par la présence de deux ponts disulfures reliant les résidus cystéines des positions 3 et 11, ainsi que 1 et 15. Étant donné leurs multiples actions physiologiques, ces peptides sont associés à plusieurs pathophysiologies; ils suscitent donc un attrait particulier pour la recherche scientifique en pharmacologie.

Trois isopeptides constituent la famille de l'endothéline: l'endothéline-1, l'endothéline-2 et l'endothéline-3. Ces peptides peuvent interagir avec deux principaux types de récepteurs, nommés ETA et ET a, selon une affinité qui leur est propre. Diverses études ont permis de déterminer les éléments structuraux importants pour la liaison de ces peptides avec les récepteurs. Ainsi, les extrémités amino et carboxy-terminales libres, les ponts disulfures, le noyau d'acides aminés hydrophobes à l'extrémité carboxy-terminale et la région regroupant trois acides aminés chargés sont des éléments clés pour l'activité biologique de ces peptides. Ce dernier paramètre nous apparaît particulièrement important et par conséquent, afin de déterminer le rôle joué par les acides aminés chargés négativement dans la formation proposée d'un lien ionique intra ou intermoléculaire, des analogues phosphatés et sulfatés de l'endothéline-1 ont été conçus avec 1' objectif de consolider ce lien encore hypothétique toutefois. Étant donné que la synthèse de tels analogues de l'endothéline-1 n'a pas encore été tentée, divers protocoles ont été évalués. De plus, l~ synthèse de ces analogues nécessitant la formation de ponts disulfures, les méthodes de cyclisation ont donc également été étudiées.

Les analogues [Ser8P04]hET -1, [Thr8P04]hET -1, [Tyr8P04]hET -1 et [Tyr8S04]hET -1 ont été assemblés par synthèse peptidique sur phase solide en utilisant des dérivés dont l'amine-a est protégée par un groupe 9-fluorènylméthyloxycarbonyle (Fmoc). Deux stratégies de protection orthogonale et de cyclisation des cystéines ont été étudiées. La première a fait appel aux groupes protecteurs acétamidométhyle (Acm) pour les cystéines en position 1 et 15 et aux grpupements triphénylméthyle (Trt) pour les résidus des positions 3 et 11. La formation des ponts disulfures s'est effectuée successivement, en solution, au moyen de deux agents d'oxydation différents: le ferricyanure de potassium et l'iode. La seconde méthode a privilégié l'usage des groupes protecteurs Trt pour les cystéines en position 1 et 15, et les dérivés cystéines méthoxytriphénylméthyle (Mmt) aux positions 3 et IL La première cyclisation a été réalisée sur résine, dans le diméthylsulfoxyde (DMSO), au moyen d'une oxydation au ferricyanure de potassium. Le dernier pont disulfure a quant à lui été formé en utilisant les mêmes agents oxydants mais avec le peptide en solution.

Un protocole de phosphorylation globale a été choisi pour obtenir les analogues phosphatés de l'endothéline-1. L'efficacité de trois agents de phosphorylation différents a été étudiée, c'est-à-dire le di-t-butyle N,N-diéthylphosphoramidite, le dibenzyle N,Ndiisopropylphosphoramidite et le dibenzylphosphochloridate. D'autre part, pour l'analogue sulfaté de l'endothéline-1, un dérivé tyrosine déjà sulfaté, le N-a.-FmocTyr( S04NH4)-COOH a été utilisé en tant que bloc de construction de la chaîne peptidique.

Les études menées sur les méthodes de cyclisation de l'endothéline-1 ont indiqué qu'une cyclisation à l'iode des analogues peptidiques de l'endothéline provoque une oxydation des résidus tryptophane et méthionine. La cyclisation sur résine, pour sa part, fait toutefois appel à des conditions de réaction plus douces ce qui permet de réduire, voire éviter, ces réactions indésirables. Par contre, cette méthode nécessite des conditions minimisant un encombrement stérique et favorisant le repliement adéquat du peptide. Les trois méthodes de phosphorylation évaluées n'ont pas permis d'obtenir en quantités utiles les analogues phosphatés attendus de l'endothéline-1. Aussi, les analyses par spectrométrie de masse ont confirmé que des réactions secondaires et irréversibles se sont produites au cours d'une ou de plusieurs étapes menant à la formation des analogues peptidiques.

Par contre, le protocole employé pour la formation de l'analogue sulfaté a conduit au produit désiré au moyen d'une procédure simple et directe. Une optimisation des étapes de ce protocole permettrait d'améliorer le rendement final de production de cet analogue.

Type de document: Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Fournier, Alain
Informations complémentaires: Résumé avec symboles
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 27 mars 2017 15:48
Dernière modification: 27 mars 2017 15:48
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/4919

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