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Contribution à l'étude du rôle de la BICP27 dans la réplication du virus de l'herpès bovin 1.

Bélanger, Barbara (1999). Contribution à l'étude du rôle de la BICP27 dans la réplication du virus de l'herpès bovin 1. Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 101 p.

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Résumé

Le virus herpès bovin 1 (BHV-1) est un pathogène d'importance économique du bétail, associé à de sévères manifestations cliniques. Pour le développement de nouveaux vaccins plus efficaces et plus sécuritaires, l'étude des gènes viraux est primordiale. Dans ce projet, le rôle du gène codant pour la BICP27 ("bovine infectious cell protein # 27") dans la réplication du BHV -1 a été étudié. Pour identifier les gènes potentiellement transactivés par la BICP27, une stratégie a été développée. Des cellules cos-7 ont été co-transfectées avec un vecteur d'expression eucaryotique exprimant la BICP27 et l'un ou l'autre d'une série de cinq cosmides recombinants représentant globalement tout le génome viral. Après avoir vérifié la présence de la BICP27 dans les cellules transfectées, les acides ribonucléiques (ARN) totaux ont été isolés, fractionnés en gels d'agarose, transférés sur une membrane de nylon puis hybridés avec les cosmides afin d'identifier les transcrits potentiellement transactivés par le polypeptide. Les cinq essais réalisés en présence du vecteur exprimant la BICP27 ont permis la détection de deux transcrits de 3,3 et 2,4 kilobases (kb ), indépendamment du cosmide à l'étude. Par contre, les essais témoins en présence du vecteur d'expression original (sans insertion) n'ont révélé aucune bande d'hybridation. Ces résultats suggèrent donc que les deux transcrits détectés correspondent à ceux générés par le vecteur d'expression recombinant pour la synthèse de la BICP27, le transcrit de 3,3 kb représentant présumément un précurseur de I'ARN messager de 2,4 kb. Parallèlement, la même stratégie a été utilisée avec un témoin positif qui est un transactivateur connu du BHV -1 : la BTIF. Un sérum anti-BTIF, préalablement développé, nous a permis de confirmer la présence de la BTIF dans les cellules co-transfectées. Pourtant, aucun transcrit spécifiquement transactivé par le polypeptide n'a pu être détecté, suggérant donc que notre stratégie n'était pas assez sensible.

Dans le but éventuel de déterminer si le gène codant la BICP27 est nécessaire dans le cycle de réplication du BHV-1, la seconde partie du projet consistait à développer les outils nécessaires à la construction d'un mutant de délétion BHV -1/BICP2T, à partir duquel les conséquences de la mutation seraient analysées in vitro puis in vivo. La procédure courante pour créer des mutants du BHV -1 consiste à co-transfecter des cellules permissives avec l'acide désoxyribonucléique (ADN) viral purifié et un plasmide de transfert recombinant dont le gène viral d'intérêt, bordé des séquences proximales intactes ( -1 000 paires de bases (pb) de chaque côté), a été soit remplacé ou inactivé par insertion d'un gène rapporteur. Le mutant désiré, généré par recombinaison homologue des séquences communes entre l'ADN plasmidique et l'ADN viral, est ensuite sélectionné selon le phénotype du gène rapporteur. Au cours des travaux, deux plasmides de transfert différents ont été construits: le premier (pKS/NJ-Blnl/13-gar} contient les séquences codantes complètes de la BICP27 à l'intérieur duquel une cassette 13-galactosidase (13-gal) a été insérée au niveau du codon 141, alors que chez le second plasmide (pKS/NJ-BlniM3ICP27/13-gar}, 93% des séquences codantes de la BICP27 ont été remplacées par la cassette 13-gal. Par la suite, la fonctionnalité de la cassette 13-gal introduite dans chacun des plasmides de transfert a été démontrée enzymatiquement dans les lysats de cellules MDBK ("Madin Darby Bovine Kidney") suite à leur transfection transitoire.

Finalement, étant donné que les données actuelles de la littérature montrent que le gène de l'ICP27 ("infectious cell protein # 27"), chez des virus herpès homologues au BHV -1, est absolument requis à la réplication virale, il fallait développer une lignée de complémentation apte à permettre la multiplication du mutant BHV-l/BICP2T, c'est-à-dire une lignée cellulaire stable qui soit capable de fournir en trans le polypeptide BICP27. Pour ce faire, un système comportant deux vecteurs a été utilisé, l'un exprimant la forme native de la BICP27 (pSV/BICP27), l'autre (pSV2neo ou pSV3neo) encodant (pSV3neo) ou non (pSV2neo) l'antigène grand T du SV40 de même qu'un marqueur de sélection eucaryotique, le gène de résistance à la généticine. Les cellules MDBK ont donc été co-transfectées avec pSV/BICP27 et soit pSV2neo ou pSV3neo puis sélectionnées en présence de généticine. Les colonies résistantes à la drogue ont été par la suite clonées à l'aide d'anneaux de clonage. Pour identifier les clones exprimant la BICP27, des lysats cellulaires de chacun des clones ont été préparés, fractionnés en gel de polyacrylamidedodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE), électrotransférés sur des membranes puis immunodétectés avec un sérum anti-BICP27. Malheureusement, aucun des clones isolés n'a révélé l'expression de la BICP27, du moins pas à un niveau détectable. Ces résultats, ajoutés à d'autres obtenus antérieurement dans notre laboratoire par le biais de divers systèmes d'expression eucaryotique constitutifs à un seul vecteur (i.e. où le gène d'intérêt et le marqueur phénotypique sont portés sur la même molécule), suggèrent que la BICP27 est toxique aux cellules. Pour pallier ces problèmes, le système d'expression inductible commercial pRetroTetOff, lequel est sensible à la présence de tétracycline (ou de doxycycline) dans le milieu, a été testé dans les cellules MD BK. Cette étude, effectuée via le vecteur recombinant pRetroTetOtlLuc encodant le gène de la luciférase sous le contrôle du promoteur inductible, a permis de démontrer que le système pRetroTetOff était fonctionnel dans les cellules MDBK. Ce système sera utilisé sous peu pour le développement d'une lignée cellulaire MDBK/BICP27+.

Type de document: Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Simard, Claire
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 01 juin 2017 16:15
Dernière modification: 25 oct. 2017 15:09
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/4911

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