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VALEUR DIAGNOSTIQUE ET VARIABILITÉ DE LA PROTÉINE CYTOSOLIQUE P36 DE MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE.

Caron, Judith (1999). VALEUR DIAGNOSTIQUE ET VARIABILITÉ DE LA PROTÉINE CYTOSOLIQUE P36 DE MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE. Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en microbiologie et biotechnologie, 164 p.

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Résumé

Mycoplasma hyopneumoniae est l'agent causal de la pneumonie enzootique porcine. Il s'agit d'une maladie respiratoire chronique qui engendre beaucoup de problèmes de santé et des pertes économiques considérables pour l'industrie de l'élevage des porcs de plusieurs pays.

M hyopneumoniae est un microorganisme très fastidieux qui partage des déterminants antigéniques communs et beaucoup de séquences homologues avec d'autres mycoplasmes porcins, notamment M. hyorhinis et M. jlocculare. De plus, il y a présence d'hétérogénéité antigénique et génomique parmi les différentes souches de M. hyopneumoniae. Conséquemment, ces difficultés entraînent une diminution de 1 'efficacité des méthodes de diagnostic présentement utilisées, en plus d'entraver la mise en place de mesures d'épidémiosurveillance et de prophylaxie.

L'objectif principal de cette recherche était d'étudier la valeur diagnostique de la protéine cytosolique p36 de M. hyopneumoniae et de mettre au point des techniques de dépistage rapides et fiables à la disposition de 1 'industrie porcine. Cette étude fut divisée en deux volets, le premier étant un volet de diagnostic moléculaire et le deuxième un volet de diagnostic immunohistochimique.

La première partie de l'étude consistait au développement d'une technique d'amplification des gènes par la réaction de la polymérase en chaîne (PCR). Le gène ciblé fut celui codant pour la protéine cytosolique p36 reconnue comme étant spécifique d'espèces, antigéniquement stable et hautement immunogène. Les amorces d'oligonucléotides synthétisées pour l'amplification de la p36 se sont avérées spécifiques à M hyopneumoniae, ne permettant pas 1' amplification de 1 'ADN et/ou 1 'ARN des autres espèces de mycoplasmes, de bactéries et de virus communément associés aux problèmes respiratoires porcins. Comparativement aux amorces utilisées pour l'amplification de fragments de gène codant pour la protéine membranaire p46, les amorces dirigées contre le gène de la p36 se sont avérées plus sensibles puisque des amplicons de la taille attendue ont été obtenus à partir de préparations ne contenant que de 0,5 à 50 pg/ml d'ADN génomique. D'autre part, les amorces dirigées contre la p46 n'ont amplifié que 0,5 ng/ml d'ADN génomique. Cette méthode PCR a été utilisée avec succès sur des spécimens cliniques, tels des homogénats de poumons et des écouvillons trachéobronchiolaires, une très bonne corrélation ayant été obtenue avec la mise en évidence de lésions pulmonaires et de signes cliniques chez les porcs testés. Une approche multiplex, permettant l'amplification simultanée du gène entier de la p36 (948 pb) et d'un fragment interne du gène codant pour la protéine p46 (580 pb), a été préconisée pour augmenter la spécificité du test.

En comparaison avec d'autres tests de détection présentement utilisés, la PCR s'avère très rapide, prenant deux jours pour l'obtention des résultats, sensible et spécifique. Aucun cas faux-positif n'a été identifié. La PCR basée sur l'amplification du gène de la p36 s'est avérée un outil extrêmement efficace pour le diagnostic de M hyopneumoniae qui pourra éventuellement être utilisé pour la surveillance de la présence de cet agent dans un troupeau.

Le volet sérologique consistait en la production d'anticorps monoclonaux dirigés contre la p36 et à 1 'étude de leur potentiel diagnostique dans un test d'immunofluorescence indirecte sur des coupes de poumons congelés, de même que pour l'identification sérologique de l'agent après isolement en milieu de culture.

Le gène de la p36 a été cloné et exprimé sous forme de protéine de fusion avec la glutathione S-transférase (GST). La protéine GST -p36 recombinante a été scindée suite à une digestion avec la thrombine, et la portion p36 enrichie a servi à l'immunisation de souris. Ces dernières développèrent une forte réponse en anticorps telle que confirmée à l'aide d'une épreuve ELISA indirecte et par immunobuvardage. Les splénocytes des souris hyperimmunes ont été utilisés dans une expérience de fusion avec les cellules myélomateuses P3x63Ag8.653 murines. Les hybridomes sécréteurs d'anticorps monoclonaux dirigés contre la p36 ont été criblés à l'aide d'une épreuve ELISA indirecte et la spécificité des anticorps a été confirmée par immunobuvardage contre la protéine p36 recombinante de même que contre la protéine native présente dans les lysats préparés à partir d'une culture de M. hyopneumoniae. Les AcMo anti-p36, d'isotype IgGlK, se sont avérés très spécifiques à M. hyopneumoniae, ne démontrant aucune réactivité envers les autres mycoplasmes porcins, notamment M arginini, M. jlocculare, M hyorhinis, M. hyosynoviae et A. laidlawii, par ELISA et immunobuvardage de type western. En tout, 9 hybridomes sécréteurs d' AcMo anti-p36 ont été établis et sous-clonés. Des liquides d'ascites ont été préparés chez des souris pristanées, leurs titres en anticorps anti-p36 étant supérieurs à 1:50000 par ELISA indirecte.

Un test d'immunofluorescence indirecte sur des coupes de poumons congelés basé sur l'utilisation d' AcMo anti-p36 à été évalué sur des spécimens provenant de porcs expérimentalement infectés à l'aide d'une souche Québécoise de M. hyopneumoniae, IAF-DM9827. Les lésions macroscopiques observées étaient confinées aux poumons, et les principaux changements histologiques consistaient en une infiltration péribronchique et péri vasculaire par des cellules lymphomonocytaires, accompagnée d'une légère hyperplasie de 1 'épithélium des bronchioles. Aucun dommage alvéolaire n'a été observé. Il a été possible à l'aide de la technique d'IFI de détecter la présence d'antigène de M. hyopneumoniae à la surface des cellules épithéliales ciliées des bronches et bronchioles. Aucune fluorescence n'a été observée dans les coupes de poumons des porcelets contrôles ne démontrant aucune lésion.

Les méthodes immunohistochimiques sont couramment utilisées par les pathologistes comme outils de diagnostic pour l'infection causée par M. hyopneumoniae, car elles permettent aussi une observation histologique des organes respiratoires. Les techniques d'immunofluorescence présentement appliquées utilisent des sérums polyclonaux, d'où la possibilité de résultats faux-positifs attribuables à la présence au niveau des poumons d'autres mycoplasmes qui partagent certains déterminants antigéniques de M hyopneumoniae. L'immunofluorescence indirecte utilisant les AcMo anti-p36 s'est avérée une méthode très spécifique, éliminant les faux-réacteurs et les réactions croisées, et très rapide, ne prenant que 2 à 3 heures pour l'obtention des résultats.

Finalement, ces AcMo se sont avérés très efficaces pour l'identification sérologique d'isolats cultivés en milieu de culture, puisqu'une réaction spécifique en immunobuvardage ne fut démontrée que contre M hyopneumoniae, et non contre M. hyorhinis et M flocculare.

Type de document: Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Dea, Serge
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 28 mars 2017 15:47
Dernière modification: 28 mars 2017 15:47
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/4900

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