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Investigation du rôle physiologique de l’hydrogénase [NiFe] à haute affinité du groupe 5 chez Streptomyces avermitilis

Liot, Quentin (2016). Investigation du rôle physiologique de l’hydrogénase [NiFe] à haute affinité du groupe 5 chez Streptomyces avermitilis Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en biologie, 133 p.

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Résumé

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La bactérie du sol Streptomyces avermitilis est un microorganisme chimioorganotrophe qui alterne entre deux modes de vie, mycélium ou spores, selon la disponibilité des nutriments dans son milieu. Bien qu’elle puisse être exposée à des concentrations d’H2 allant jusqu’à 10 000 ppmv en périphérie des nodules racinaires, cette bactérie possède la propriété exceptionnelle d’oxyder l’H2 à des concentrations troposphériques (0,53 ppmv) avec une très haute affinité (Km(app) = 51 ppmv), cette activité étant restreinte aux spores uniquement. On retrouve dans son génome un groupe de gènes codant pour une hydrogénase [NiFe] à haute affinité (HHA) hypothétique, récemment caractérisée in silico. Les HHA se retrouvent principalement chez les actinobactéries, mais elles sont également détectées chez certaines acidobactéries, des protéobactéries et des chloroflexi. Le rôle physiologique de ces hydrogénases au Km atypique est encore méconnu, malgré leur grande importance dans le bilan atmosphérique global de l’H2. Considérant l’expression de l’HHA dans les spores de S. avermitilis et son potentiel théorique suffisant pour combler les besoins énergétiques liés à la maintenance, l’hypothèse générale qui a fait l’objet de cette thèse de doctorat est que l’HHA joue un rôle dans la viabilité des spores chez les streptomycètes. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons d’abord entrepris une étude transcriptomique sur des spores de S. avermitilis incubées en présence d’H2 atmosphérique (0,53 ppmv) ou en saturant l’enzyme avec son substrat (500 ppmv), pour en analyser l’expression des gènes et en déduire l’impact sur la physiologie de la cellule. Cette expérience a révélé l’existence d’un nouveau mode de mixotrophie où les besoins énergétiques de la bactérie seraient comblés par l’H2, avec une diminution de sa dépendance aux sources de carbone organique du milieu. L’augmentation de la concentration d’H2, et donc de l’énergie apportée via l’hydrogénase, a effectivement menée à une sous-expression des enzymes impliquées dans le transport et le métabolisme des composés organiques, en plus des sous-unités de la ADH-déshydrogénase faisant le lien entre le catabolisme du carbone et la production d’ATP. Contrairement à la convention voulant que la mixotrophie additionne les sources d’énergies organique et inorganique pour supporter la croissance, la mixotrophie chez les streptomycètes est impliquée dans la dormance uniquement. Elle balancerait les sources d’énergie pour maintenir le métabolisme minimal en privilégiant l’utilisation du substrat inorganique, biquitaire, virtuellement illimité, et ne nécessitant qu’une seule enzyme, tout en complétant les besoins énergétiques résiduels par le métabolisme de composés organiques, limités, très diversifiés, et requérant un large éventail d’enzymes car réfractaires au métabolisme. En plus de l’impact sur le métabolisme énergétique des spores, l’exposition à l’H2 a entraîné des variations dans l’expression des gènes impliqués dans le métabolisme secondaire. L’apport d’énergie supplémentaire a entraîné la sousexpression de la ppGpp-synthase synthétisant l’alarmone Guanosine Pentaphosphate (ppGpp), responsable de la réponse stringente. L’effet du ppGpp étant pléiotrope, on lui a associé la sous-expression de nombreux gènes impliqués dans la réponse au stress et le métabolisme lié aux antibiotiques (synthèse et défense) observée en présence de hautes concentrations d’H2. Pour confirmer le rôle physiologique de l’HHA dans une mixotrophie atypique, nous avons finalement entrepris l’élaboration d’un mutant de délétion pour ses gènes structuraux hhySL. Cette mutation n’a eu aucun impact sur la croissance du mycélium végétatif ou la maturation des spores. L’abolition de l’activité hydrogénase a cependant mené à une baisse drastique (- 76%) de la viabilité des spores chez la souche mutante. L’HHA st donc impliquée dans une nouvelle forme de mixotrophie que nous avons nommée « mixotrophie de survie », exclusive aux streptomycètes. Cette thèse constitue un apport mportant dans le domaine de la biogéochimie de l’H2. Effectivement, nous sommes les premiers à démontrer que le rôle physiologique de l’HHA des streptomycètes se distingue de celui retrouvé chez d’autres actinobactéries, telle que Mycobacterium smegmatis exprimant l’HHA dès la phase de croissance exponentielle en suivant un mode mixotrophique classique. La réponse des bactéries oxydant l’H2 exposées à des sources d’H2 diffuses dans l’environnement serait donc plus complexe que la notion de juxtaposition des bactéries en fonction de leur affinité pour leur substrat actuellement acceptée dans la littérature. L’impact de la mixotrophie de survie reste donc à être évalué d’un point de vue écologique, celle-ci pouvant moduler la structure et les fonctions des communautés microbiennes du sol via la persistance et la production de métabolites secondaires.

Abstract

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The soil bacterium Streptomyces avermitilis is a hemoorganotrophic microorganism that alternates between two life stages, mycelium or spores, according to the abundance or deficiency of nutrients in its medium. Although it can be exposed to H2 concentrations up to 10,000 ppmv on the outskirts of the root nodules, this bacterium has the unique property of oxidizing H2 in tropospheric concentrations (0,53 ppmv) with a very high affinity Km(app) = 51 ppmv), this activity being restricted to spores only. We found in its genome a gene cluster encoding an hypothetical high affinity [NiFe] hydrogenase (HAH) recently characterized in silico. The HAH is mainly found in actinobacteria, but it is also detected in some acidobacteria, proteobacteria and chloroflexi. The physiological role of this hydrogenase arboring an atypical Km is still unknown, despite its importance in the overall assessment of atmospheric H2. Considering its expression in the spores and the sufficient theoretical energy potential to meet the energy needs for maintenance, the general assumption that is the subject of this doctoral thesis is that the HAH plays a role in the survival of spores in streptomycetes. In order to challenge this hypothesis, we first undertook a transcriptomic study of S. avermitilis spores, incubated in the presence of atmospheric H2 (0,53 ppmv) or saturating the enzyme with its substrate (500 ppmv), to analyze gene expression and deducing the impact on cell physiology. This experiment revealed the existence of a new mode of mixotrophy where energy needs of the bacterium are met by H2, with a reduction of its dependence on organic carbon sources. Increasing the H2 concentration, and therefore the energy supplied via the hydrogenase, effectively led to an underexpression of the enzymes nvolved in the transport and metabolism of organic compounds, in addition to the NADH dehydrogenase subunits, linking carbon catabolism and ATP production. Unlike the conventional wisdom that mixotrophy adds sources of organic and inorganic energies to support growth, this mixotrophy in streptomycetes is involved in dormancy only. It would balance energy sources to maintain a minimal metabolism by favouring the use of inorganic substrate, ubiquitous, virtually unlimited, and requiring only one enzyme, while completing the remaining energy needs by the metabolism of organic compounds, limited, very diverse, requiring a wide range of enzymes, and resistant to metabolism. In addition to the impact on energy metabolism of spores, exposure to H2 resulted in variations in the expression of genes involved in secondary metabolism. The additional energy supply has resulted in the underexpression of ppGpp ynthase synthesizing the alarmone Guanosine pentaphosphate (ppGpp), responsible for the stringent response. The effect of ppGpp being pleiotropic, it was associated with the under-expression of many genes involved in stress response and secondary metabolism linked to antibiotics (synthesis and defense) observed in the presence of high H2 oncentrations. To confirm the physiological role of the HHA in such an atypical mixotrophy, we finally began developing a deletion mutant in its structural genes hhySL. This mutation had no impact on the growth of vegetative mycelium nor maturation of spores. The abolition of all hydrogenase activity has, however, led to a drastic decline (-76%) in the viability of spores in the mutant strain. The HAH is therefore involved in a new form of mixotrophy which we named "survival mixotrophy", for now exclusive to Streptomyces. This thesis is therefore an important ontribution in the field of biogeochemistry of H2. Indeed, we are the first to demonstrate that the physiological role of the Streptomyces’HAH differs from that found in other actinobacteria such as Mycobacterium smegmatis, expressing the HAH during the exponential growth phase and following a conventional mixotrophic mode. The response of H2 oxidizing bacteria exposed to diffuse sources of H2 in the environment would thus be more complex than the concept of juxtaposition of bacteria based on their affinity to their substrate, as currently accepted in the literature. The impact of survival mixotrophy remains to be assessed from an ecological point of view, as it can modulate the structure and function of soil microbial communities hrough persistence and production of secondary metabolites.

Type de document: Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Constant, Philippe
Mots-clés libres: actinobactéries; streptomycètes; hydrogénase NiFe du groupe 5; gaz traces; mixotrophie; réserve de biomasse microbienne; persistance microbienne; mixotrophie de survie; actinobacteria; streptomyces; group 5 [NiFe] hydrogenase; trace gas; mixotrophy;microbial seed bank; microbial persistence; survival mixotrophy
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 03 avr. 2017 19:31
Dernière modification: 03 avr. 2017 19:31
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/4853

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