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Optimisation de la production d'acide succinique chez Methylbacterium extorquens par le biais de petits arn régulateurs

Imane, Roqaya (2016). Optimisation de la production d'acide succinique chez Methylbacterium extorquens par le biais de petits arn régulateurs Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 71 p.

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Résumé

Les ARN régulateurs (sARN) sont des petits ARN qui ont la capacité de réguler l’expression de gènes chez les bactéries. Du fait de leur grande capacité de régulation, ils pourraient être utilisés comme outil en ingénierie métabolique dans la production de certains métabolites, tel que l’acide succinique. Ce dernier est un diacide carboxylique présent dans tous les êtres vivants. Il est aussi utilisé dans de nombreux domaines tels que l’agro-alimentaire, le textile, la pharmaceutique, les cosmétiques ou encore la production de plastiques. La synthèse de l’acide succinique peut se faire de façon chimique à partir de matières premières fossiles tels que le pétrole et le gaz naturel. Toutefois, ces matières deviennent de plus en plus rares et chères, et elles sont polluantes. Il est donc préférable d’avoir recours à la biotechnologie, si possible en évitant l’utilisation de produits provenant de l’agriculture comme source de carbone pour les microorganismes. Methylobacterium extorquens est une bactérie à Gram négatif et méthylotrophe, donc capable de croître sur le méthanol. L’hypothèse de ce projet est qu’il est possible d’avoir recours aux sARN pour favoriser la production d’acide succinique par cette bactérie. Cependant, la taille du sARN à synthétiser est importante dans la mesure où plus sa séquence est longue, plus il peut avoir des interactions non spécifiques ou une efficacité réduite de liaison de la séquence désirée avec la cible choisie. Il est donc nécessaire de minimiser les séquences inutiles qui peuvent se trouver sur le promoteur. Étant donné que ce système a été testé avec succès chez Escherichia coli, il faut aussi tester la preuve de concept d’inhibition des gènes chez M. extorquens avec des petits ARNs contre le gène gfp aussi, et finalement cibler les gènes dont l’inhibition a le potentiel de permettre une augmentation de la production d’acide succinique. Une version tronquée du promoteur PmxaF a pu induire l’expression des sARN. Il a toutefois été difficile de prouver l’effet sur sARN sur le gène gfp dû à la non concordance des contrôles.

Abstract

Small regulatory RNAs (sRNAs) are short, noncoding RNAs that control gene expression in bacteria and have the ability to bind the messenger RNA and inhibit translation. They can be used in any application that requires the modification of gene expression, such as metabolic engineering: an approach that aims to produce high yields of chosen metabolites like succinic acid. This consists in identifying potential genetic targets whose inhibition would allow increased production of succinic acid. It is a diacarboxylic acid found in all living organisms and used in several industries such as food, pharmaceutical, cosmetic, textile and plastic production. Succinic acid can be synthesised chemically from fossil fuels such as oil and natural gas. However, these materials are becoming increasingly scarce, expensive, and polluting. It is therefore preferable to use biotechnology, thanks to which it is possible to avoid the use of products from agriculture as a carbon source for microorganism. Methylobacterium extorquens is a methylotrophic Gram-negative bacterium, able to grow on methanol. It is thus a good candidate to avoid using agricultural products as a carbon source for microorganisms used in large-scale biotechnology production. The hypothesis of the project is that it is possible to use small RNA to enhance succinic acid production via this bacterium. Several different types of sRNA(s) can be synthesized to target distinct genes within the metabolic pathways necessary for the production of the succinic acid. The key element of the synthesized sRNA is a sequence complementary to the target. sRNA transcription also requires a promoter which will needs to be carefully cloned to avoid unnecessary sequences in the sRNA. The longer the sRNA sequence, the higher the possibility for non-specific interactions or a reduced binding efficiency with the desired target sequence can occur. While the engineered sRNA-system has been proven useful in E. coli, it has not been used in other bacteria yet. We have built such a system in Methylobacterium extorquens. A shortened-promoter was cloned and shown to function to express the Green Fluorescent Protein (GFP) reporter gene. The next step was to target a gfp reporter with appropriate sRNAs in order to prove the feasibility of targeting any genes but it was difficult to prove the effect of sARN on the gfp gene due to the mismatch controls.

Type de document: Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Perreault, Jonathan
Mots-clés libres: Acide ribonucléique; Cycle de Krebs; Métabolisme
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 20 déc. 2016 20:16
Dernière modification: 20 déc. 2016 20:16
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/4813

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