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The identification (phage display) of peptide molecules with potential application in anti-cancer therapy (Identification par banque phagique de peptides ayant un potentiel thérapeutique anti-cancéreux)

Popkov, Mikhail (2001). The identification (phage display) of peptide molecules with potential application in anti-cancer therapy (Identification par banque phagique de peptides ayant un potentiel thérapeutique anti-cancéreux) Thèse. Québec, Université du Québec. Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en virologie et immunologie, 182 p.

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Résumé

En dépit des progrès considérables apportés au cours des trente dernières années au diagnostic et au traitement du cancer, les statistiques indiquent que les thérapies actuelles ne procurent qu'une probabilité de survie de cinq (5) ans dans environ 40% des cas. Actuellement, la méthode de choix pour le traitement de la majorité des cas de cancer est la chirurgie, suivie de la radiothérapie et de la chimiothérapie. Cependant, ces traitements ne permettent pas de traiter certains des cancers les plus fréquents en plus de causer des effets secondaires sévères reliés à leur utilisation. Plusieurs raisons peuvent expliquer l'échec de ces traitements. D'abord certaines tumeurs ne peuvent être traitées en raison de leur localisation ou de leur dispersion métastatique, mais également à cause de leur faible sensibilité à la radiothérapie ou à la chimiothérapie. En outre, ces méthodes ne sont certainement pas idéales pour le traitement des néoplasies considérant la morbidité qui leur est associée.

En conséquence, de nombreuses autres approches ont été tentées dans le but d'améliorer le taux de survie des patients à haut risque de récidive. Ces approches incluent l'immunothérapie seule ou en combinaison avec la chimiothérapie.

L'hypothèse de l'utilisation du système immunitaire pour éradiquer une tumeur n'est pas nouvelle. Il y a plus de cent ans, William Coley (en 1893) était le premier à publier une étude montrant qu'une activation non-spécifique du système immunitaire à l'aide de toxines bactériennes pouvait causer une régression tumorale (sarcome métastatique). Les bienfaits de la «toxine de Coley)) demeurent encore controversés mais il reste que ce chercheur avait clairement démontré une régression tumorale ainsi qu'une survie prolongée chez certains patients. Les efforts héroïques de Coley lui ont valu le titre de «Père de l'Immunothérapie)), bien avant que les principes fondamentaux de l'immunologie ne soient élucidés.

Avec les progrès récents accomplis dans l'élucidation du mécanisme d'action du système immunitaire et le développement de la technologie des hybridomes, le concept stipulant que l'immunothérapie représente un outil thérapeutique valable pour le traitement du cancer est devenu une réalité. L'avènement des anticorps monoclonaux (AcMo) a permis le développement de thérapies ciblant directement la tumeur, que ce soit par le biais de mécanismes effecteurs anticorps-dépendant ou d'immunoconjugués (par exemple, une drogue, un isotope ou une toxine couplé à un anticorps). Au cours des quinze ou vingt dernières années, les AcMo sont passés du laboratoire aux essais cliniques pour le traitement d'un grand nombre de cancers variés. Plusieurs AcMo sont maintenant en phase clinique avancée et pourraient être introduits sur le marché au cours des prochaines années. Ces résultats sont sans nul doute impressionnants; toutefois, l'utilisation des AcMo comporte encore plusieurs contraintes physiques, biologiques et immunologiques pouvant limiter leur utilité clinique.

Le travail décrit dans cette thèse porte sur l'identification de molécules peptidiques pouvant être utilisées dans la thérapie anti-cancer. Cette étude a débuté à une période où les progrès en biologie moléculaire (banques peptidiques aléatoires ou BPAs) permettaient de développer des outils permettant de surmonter plusieurs difficultés. Les BP As exprimées à la surface de phages filamenteux sont des outils versatiles pour identifier des épitopes détectés par des anticorps monoclonaux et autres molécules de liaison. Les séquences d'épitope, obtenues à partir du criblage de ces banques avec des anticorps, montrant de surcroît une divergence de séquence significative avec 1 'antigène originel, sont appelées mimotopes. Les mimotopes peptidiques sont d'un intérêt considérable à cause de leur utilisation potentielle pour le développement de vaccins anti-cancer. Toutefois, il y a encore peu de données disponibles sur le potentiel des mimotopes à induire une réponse humorale pouvant reconnaître 1' antigène originel. De même, il y a encore peu d'information disponible sur le mécanisme d'action des anticorps anti -mimotope.

Bien que l'expression sur un phage (phage display) mène à plusieurs applications, le but de ce projet de doctorat était de découvrir des mimotopes pouvant être reconnus par l' AcMo murin BCD-F9 et d'utiliser ces mimotopes comme outil d'immunothérapie dans un modèle de xénogreffe sur souris nue. Bien que le travail présenté porte principalement sur le traitement du fibrosarcome humain, les concepts peuvent être appliqués à tous les types de tumeurs. Les implications de la découverte des mimotopes dans la compréhension des mécanismes d'action de la glycoprotéine-P (P-gp) sont aussi décrites.

Nous avons démontré que l'épitope reconnu par l'AcMo BCD-F9 n'était pas restreint aux lignées cellulaires de cancer du sein. Les observations décrites dans cette étude suggèrent que cet épitope est aussi présent en plus ou moins grande quantité à la surface de plusieurs d'autres lignées cellulaires néoplasiques: carcinome du colon, sarcome, lymphome et leucémie. Leur réactivité commune avec BCD-F9 implique que ces lignées cellulaires partagent un antigène de surface ou expriment différentes molécules portant des épitopes à réactivité croisée.

La réactivité de 1' Ac Mo BCD-F9 avec le fibrosarcome humain HT -1 080 nous a permis d'utiliser cette lignée cellulaire pour l'étude des propriétés anti-tumorales de BCD-F9 dans un modèle expérimental animal. Nos résultats ont montré que l'inoculation i.v. répétée de BCD-F9 à des souris nues CD-1, chez lesquelles les cellules HT -1080 étaient transplantées, réduisait de manière significative la croissance tumorale chez les animaux transplantés par voie s.c.. Ce même traitement abrogeait complètement le développement de métastases pulmonaires des souris transplantées par voie i.v .. Nos études in vitro de la lyse BCD-F9-dépendante de cellules HT-1080 ont confirmé que la cytotoxicité cellulaire anticorps-dépendante (ADCC) et la cytotoxicité anticorps-dépendante médiée par le complément (ADCMC) peuvent être impliquées dans l'activité anti-tumorale observée chez les animaux traités avec le BCD-F9. Le large spectre de lignées néoplasiques reconnues par BCD-F9 suggère que cet AcMo pourrait être un agent immunothérapeutique efficace. À cet égard, il serait intéressant de répéter avec d'autres cellules tumorales humaines les expériences examinant 1 'effet de BCD-F9 sur la croissance du fibrosarcome HT -1 080 et les métastases en originant.

Nous avons également utilisé l'AcMo BCD-F9 pour identifier à l'aide des BPAs des peptides pouvant simuler l'épi tope reconnaissant cet anticorps. Le phage choisi exprimait le peptide GRRPGGWWMR, qui pouvait se lier à l' AcMo BCD-F9. L'immunisation de lapins avec ce peptide-mimotope synthétique induisait des anticorps polyclonaux (AM-F9) capables de bloquer la liaison d' AcMo BCD-F9 aux cellules tumorales HT-1080. À l'aide d'un modèle de métastases pulmonaires agressives, nous avons démontré que l'administration i.v. de l' AM-F9 prolongeait significativement la survie de souris nues CD-1 inoculées i.v. avec des cellules de fibrosarcome humain HT-1080.

Ces observations initiales ont été suivies d'une autre étude examinant les propriétés de l'antisérum AM-F9. Nous avons démontré que le traitement avec AM-F9 inhibait de manière significative la croissance des cellules tumorales HT -1 080 inoculées s.c. à des souris nues CD-1. Nous avons aussi étudié 1 'activité anti-tumorale de 1' AM-F9 in vitro à l'aide d'essais ADCMC et AOCC. Nous avons démontré que, dans ce modèle, l' ADCMC jouait vraisemblablement un rôle majeur dans la lyse des cellules tumorales. Ces observations suggèrent que les mimotopes peptidiques induisent une réponse anti-tumorale bénéfique et peuvent ainsi être utilisés pour l'immunothérapie.

Les mimotopes peptidiques sont aussi importants pour la simulation de la liaison de substances non-protéiques, telles que des drogues chimiothérapeutiques à faible poids moléculaire. Nous avons donc utilisé les banques de phages pour identifier des ligands peptidiques pouvant se lier aux drogues MDR, simulant de ce fait l'activité de liaison de la P-gp. Nous avons démontré que les phages exprimant des peptides, contenant la séquence canonique WXXW, se liaient à des drogues de type MOR (vinblastine, doxorubicine, vérapamil et génistéine) avec la même sélectivité que la P-gp mais n'interagissaient pas avec des drogues de type non-MOR, telles que l'arabinosylcytosine (Ara-C) et le melphalan. Nous avons aussi démontré qu'un anticorps polyclonal obtenu contre le phage exprimant le peptide VCDWWGWGIC pouvait reconnaître de manière spécifique la P-gp dans la fraction membranaire de cellules MCF-7ADR à phénotype MDR. Les séquences se liant aux drogues MDR que nous avons identifiées dans ce travail fournissent un outil important pour le design et le criblage de nouveaux agents chimiothérapeutiques.

Abstract

The advent of mAbs has allowed the development of tumor directed therapies utilizing antibody-dependent effector mechanisms and immunoconjugates ( e.g. drug, isotope and toxin coupled antibodies) against human malignancies. Random peptide libraries displayed on the surface of filamentous phage are a versatile tool for identifying protein epitopes detected by monoclonal antibodies and other binding molecules. Epitope sequences derived by screening these libraries with antibodies, which show significant sequence divergence from the native antigens, are also referred to as mimotopes. Peptide mimotopes are of considerable interest because of their potential for use in anti-cancer vaccine development. However, there are limited data on whether mimotopes so derived can induce a humoral response that recognizes native antigens. Also, at the present time, very little information is available on the mechanism of action of any of the antimimotope antibodies. To this end, we constructed phage epitope libraries and screened them with a mouse monoclonal antibody BCD-F9 (mAb). Hereafter, we report that (1) the phage that was selected encoded for the unique sequence GRRPGGWWMR representing the peptide capable of binding to the BCD-F9 mAb. (2) Polyclonalm antibodies (AM-F9) generated by immunization of rabbits with this synthetic peptide specifically bound to HT-1080 cells and inhibited the binding of the BCD-F9 antibody to these cells. (3) Using an aggressive lung metastatic model, we demonstrated that AM-F9 administrated i. v. significantly prolonged the life span of CD-1 nude mice inoculated s.c. with HT-1080 human fibrosarcoma cells. (4) We also showed that the administration of AM-F9 to CD-1 nude mice inoculated s.c. with HT -1080 cells led to a significant inhibition of tumor growth. (5) We also investigated the anti-tumor activity of AM-F9 in vitro in ADCMC and ADCC assays, and demonstrated that, in this model, ADCMC is likely to be a major mechanism responsible for tumor cell killing. These results indicate that peptide mimotopes can potentially be used as a novel immunotherapy to induce a beneficial antitumor response.

Peptide mimotopes are also of importance in mimicking the binding of non-proteineceous substances such as, for example, low molecular chemotherapeutic drugs. We used therefore phage display libraries to generate peptide ligands that can bind MOR drugs mimicking, in this respect, the drug binding activity of P-glycoprotein. We showed that (6) the phages expressing the peptides, which contain the core consensus motif WXXW, bound MDR type drugs (vinblastine, doxorubicin, verapamil, and genistein) with the same selectivity as P-glycoprotein and did not interact with non-MDR type drugs, such as arabinosylcytosine (Ara-C) and melphalan. (7) Most importantly, we showed that monospecific antibody obtained against the phage expressing VCDWWGWGIC peptide could specifically recognize P-glycoprotein in the membrane fraction of MDR phenotype MCF-7 ADR cells. The MDR drug-binding sequences generated during this work could provide an important tool for design and screening of new chemotherapeutical agents.

Type de document: Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Mandeville, Rosemonde
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 03 avr. 2017 19:30
Dernière modification: 03 avr. 2017 19:30
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/4503

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