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Étude de l'influence du méthanol sur la production extracellulaire de la GFP par Pichia pastoris.

Desautels, Catherine (2001). Étude de l'influence du méthanol sur la production extracellulaire de la GFP par Pichia pastoris. Mémoire. Québec, Université du Québec. Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 131 p.

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Résumé

L'utilisation de micro-organismes pour la production de protéines recombinantes répond à un besoin actuel des industries du secteur des biotechnologies. Grâce à ses nombreux avantages, la levure méthylotrophe Pichia pastoris est de plus en plus utilisée pour la production industrielle de protéines provenant d'organismes variés. Pour ce faire, le gène codant pour la protéine à produire est cloné sous le contrôle du promoteur fort de l'alcool oxydase (AOXI), induit par la présence du méthanol. Dans le cadre de ce projet de maîtrise, la levure P. pastoris est utilisée comme hôte pour produire et sécréter la «GFP», «Green Fluorescent Protein» ou protéine fluorescente verte. La fluorescence de la GFP étant directement proportionnelle à sa concentration, celle-ci peut-être utilisée comme protéine modèle pour étudier 1' effet de différents paramètres sur la production de protéines hétérologues.

Ce projet avait pour but d'étudier l'influence de la stratégie d'alimentation en méthanol sur la production et la sécrétion de la GFP par Pichia pastoris. En effet, l'utilisation du méthanol, alcool inflammable et explosif, est sujet d'inquiétudes pour la production de protéines recombinantes à grande échelle par P. pastoris.

Trois séries de fermentation en Erlenrneyers agités ont été effectuées comme première partie de ce travail de recherche. Dans un deuxième temps, des informations supplémentaires sur la culture ont pu être obtenues grâce à 8 fermentations en bioréacteur de 20· L équipé d'appareils d'analyse en continu. Dans tous les cas, le procédé utilisé pour produire la GFP par Pichia pastoris était séparé en deux étapes : d'abord une augmentation de la biomasse a été obtenue par la croissance des cellules sur un milieu riche à base de glycérol, puis la production de GFP a été induite par l'ajout de méthanol. Des stratégies d'ajout du méthanol variant en terme de fréquence et de quantité ont été essayées et comparées avec les résultats décrits dans la littérature scientifique.

Parmi les stratégies testées, il a été démontré qu'un ajout unique d'une concentration en méthanol de 1 %(v/v) au début de la phase d'induction permettait d'obtenir de meilleurs résultats en terme de rendement (quantité de GFP sécrétée par quantité de méthanol ajouté) et de productivité (quantité de GFP sécrétée par volume de culture, par heure). Cette stratégie a 1' avantage de diminuer le temps de production, la quantité totale de méthanol utilisée pour l'ensemble du procédé ainsi que les manipulations effectuées avec le méthanol par rapport aux autres stratégies testées. Nous croyons que ce nouveau protocole d'alimentation en méthanol permettra de minimiser les risques associés à l'utilisation de ce substrat pour produire des protéines recombinantes à grande échelle avec Pichia pastoris.

Type de document: Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Lépine, François
Co-directeurs de mémoire/thèse: Groleau, Denis (CNRC-IRB)
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 12 oct. 2016 15:23
Dernière modification: 12 oct. 2016 15:23
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/4495

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