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Ingénierie de la dioxygénase du biphényle par la procédé de recombinaison aléatoire in vitro sur une région ciblée de bphA

Plante, Marie-Michèle (2001). Ingénierie de la dioxygénase du biphényle par la procédé de recombinaison aléatoire in vitro sur une région ciblée de bphA Mémoire. Québec, Université du Québec. Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 126 p.

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Résumé

Les biphényles polychlorés (BPC) fortement substitués sont reconnus comme étant très résistants au catabolisme oxydatif bactérien particulièrement lors de l'attaque effectuée par la biphényle 2,3-dioxygénase (BPDO). La biodégradation des BPC dépend de l'habileté d'oxygénation de la BPDO. La séquence des gènes bphAEFG, codant respectivement pour chacun des constituants de la dioxygénase est connue, les enzymes correspondantes ont déjà été purifiées et caractérisées. Des études antérieures ont montré que des modifications structurelles dans la portion C-terminale de la sous-unité a de la composante oxygénase, une région comprise entre les résidus Tyr295 et Glu449, influence les propriétés catalytiques de l'enzyme envers des congénères BPC. Cependant, à ce jour, dans le cas de la BPDO, nous ignorons si le fait d'accroître sa réactivité envers un congénère BPC précis peut accroître son potentiel d'action envers un spectre de congénères BPC élargi qu'aucune souche bactérienne ne peut dégrader ou si les modifications apportées à l'enzyme réduiront son spectre d'action. L'objectif du projet a été de modifier la structure de la région C-terminale de la sous-unité a par le procédé de recombinaison aléatoire in vitro afin de sélectionner des dioxygénases variantes possédant une réactivité accrue envers un congénère ciblé: le 2,2'dichlorobiphényle. Pour atteindre cet objectif, nous avons mis au point un nouveau protocole de criblage de BPDO hybrides qui est basé sur l'observation selon laquelle le catéchol résultant de l'oxygénation du substrat peut s'oxyder à l'air ambiant pour donner une coloration brunâtre. La région C-terminale de la sous-unité a , que nous avons choisie, correspondait à un fragment d'ADN délimité par les sites Mlul et Avril de bphA. Nous avons donc appliqué le procédé d'évolution in vitro dans la portion Mlui!Avrll de bphA des souches Comamonas testosteroni B-356 et Burkholderia sp. LB400 qui présentent une homologie de séquence génétique de 75% et dont les dioxygénases possèdent des spécificités différentes envers des congénères BPC. La capacité catalytique des hybrides obtenus fut analysée sur l'Aroclor 1242 et sur un mélange de congénères BPC ciblés permettant l'identification d'une spécialisation ou d'un accroissement d'activité. Ces travaux ont permis d'isoler plusieurs hybrides d'intérêt présentant une activité accrue, à la fois, envers des congénères BPC fortement chlorés difficilement dégradés par les souches parentales ainsi qu'envers certains BPC, comme le 2,6- dichlorobiphényle qu'aucune souche bactérienne connue, à ce jour, ne peut dégrader. L'analyse de leur séquence a révélé que les variants les plus prometteurs présentaient des substitutions dans la région III de la portion C-terminale de la sous-unité a confirmant l'importance de cette région sur la spécificité de la dioxygénase. Ces résultats démontrent donc de manière évidente que le procédé de recombinaison aléatoire in vitro constitue une approche des plus intéressantes et efficace dans le but de générer de nouvelles dioxygénases pour la biodégradation des BPC.

Type de document: Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Sylvestre, Michel
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 12 oct. 2016 18:19
Dernière modification: 12 oct. 2016 18:19
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/4489

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