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Purification et caractérisation de la protéine BxIE de Streptomyces lividans.

Hay, Valérie (2001). Purification et caractérisation de la protéine BxIE de Streptomyces lividans. Mémoire. Québec, Université du Québec. Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 147 p.

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Résumé

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Le xylane est un hétéropolymère abondant dans la biomasse végétale que Streptomyces lividans est en mesure d'utiliser comme source de carbone. Les enzymes du complexe xylanolytique sont sécrétées afin de dégrader cet hétéropolymère et ainsi générer des produits ayant des degrés de polymérisation variant entre un et trois monomères de xylose. Ces sucres peuvent ensuite être transloqués à travers la paroi bactérienne à l'aide du système de transport du complexe xylanolytique. Une des premières protéines interagissant avec les saccharides provenant de la dégradation de l’hémicellulose lors de leur transport est BxlE, une lipoprotéine. Les gènes codant pour le système de translocation des sucres se retrouvent au sein de 1'opéron bxl qui ont été séquencés par Larocque en 1998.

Le premier objectif du projet était l'étude de cette lipoprotéine, BxlE. La purification de BxlE à 1' aide d'une protéine de fusion et une certaine caractérisation ont été réalisées. Cette caractérisation était importante puisqu'elle permettait d'identifier les sucres pouvant interagir avec BxlE et ce, afin de connaître les inducteurs potentiels du système de dégradation du xylane. La fluorescence intrinsèque de la protéine de fusion a été utilisée afin de détecter la liaison entre le domaine BxlE et différents sucres. Par cette méthode, il a été déterminé que les différents polymères de xylose étaient en mesure de se lier à BxlE avec différentes affinités. Ainsi, le xylopentaose (X5) n'interagit pas avec BxlE. L'ordre de préférence qui a pu être déterminé est: X5 plus petit queX4 plus petit que X plus petit queX3 plus petit que X2. Des monomères comme le glucose (Gl) et le galactose ont aussi été essayés. De plus, des dimères de sucres telle cellobiose (02), le maltose, le melibiose et le lactose ont été testés en plus du xylobiose (X2), afin de déterminer s'ils étaient en mesure d'interagir avec la lipoprotéine BxlE.

La deuxième facette du projet consistait à utiliser le peptide signal de BxlE afin de diriger, vers la paroi, une protéine d'intérêt industriel. L'ancrage d'une telle protéine permettrait son couplage à un support solide sans méthode chimique risquant d'altérer ses propriétés biochimiques. Le modèle utilisé fut celui de la xylanase A2 (domaine catalytique de la xylanase A de S. lividans). Le mycélium de S. lividans exprimant cette nouvelle protéine de fusion (peptide signal de BxlE et xylanase A2 : fusionEA) a été inactivé à l'aide de deux méthodes: azoture de sodium et formaldéhyde. Par la suite, une caractérisation a été réalisée afin de s'assurer que la protéine fusionEA demeurait associée au mycélium et que l'activité xylanasique était conservée. Étant donné que le mycélium était métaboliquement inactif et qu'une activité de dégradation était détectée, l'enzyme devait logiquement être associée à la membrane, vers l'extérieur de la bactérie. Par conséquent, la microscopie électronique a été utilisée afin de tenter d'observer la densité de protéines fusionEA à la surface de la bactérie. Malheureusement, aucune enzyme n'a pu être détectée. Ces résultats paraissaient contradictoires, mais l'activité mesurée était faible et les parois ont pu être altérées lors des différentes étapes de conservation. De nouvelles expériences devront donc être envisagées afin d'établir la bonne méthode de conservation de cette souche ou d'établir les éléments génétiques nécessaires à 1'expression de ce type de protéine de fusion chez S. lividans.

Type de document: Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Shareck, François
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 12 oct. 2016 18:25
Dernière modification: 12 oct. 2016 18:25
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/4482

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