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Conception d'une stratégie de production opérationnelle de biopesticide à base de Bacillus thuringiensis utilisant les boues d'épuration comme substrat de fermentation.

Yezza, Abdessalem (2005). Conception d'une stratégie de production opérationnelle de biopesticide à base de Bacillus thuringiensis utilisant les boues d'épuration comme substrat de fermentation. Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en sciences de l'eau, 287 p.

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Résumé

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Les efforts de recherche sur la production de biopesticides à base de Bacillus thuringiensis ont porté sur le développement de milieux de culture à base de matières tertiaires abondantes et disponibles permettant de réduire les coûts de production, principalement ceux liés au choix du milieu de culture. L'une des avancées les plus intéressantes est le développement d'un procédé de production de biopesticides à base de Bt utilisant les boues d'épuration comme substrat. L'optimisation des divers paramètres de fermentation (température, contrôle de pH, agitation, aération et KLa), ainsi que l'optimisation du milieu de culture (pourcentage et âge de l'inoculum, la concentration de matières en suspension, le ratio C/N et les divers pré-traitements des boues) ont permis d'obtenir des progrès significatifs au domaine de l'efficacité de la méthode de fermentation et de l'entomotoxicité du produit final. Toutefois, sans une connaissance poussée de la mise à l'échelle, ces améliorations demeurent insuffisantes pour juger de l'efficacité industrielle de la méthode et de la capacité concurrentielle du produit. L'objectif principal de ce travail de recherche consiste donc à développer une technologie faisable à grande échelle pour la production de biopesticides à base de Bt utilisant les boues d'épuration comme substrat de fermentation. L'ensemble des stratégies développées dans cette étude montre clairement qu'il est possible d'améliorer les performances du procédé. À l'échelle pilote, une amélioration de 30 % du potentiel entomotoxique fut constatée. La plus haute activité protéolytique fut obtenue à l'échelle pilote (4,1 UI/mL) en raison d'un meilleur transfert d'oxygène. Ces améliorations permettraient de concurrencer sérieusement les procédés de production classique, tant du point de vue de la rentabilité que de celui de la fiabilité. 1) Une simple stratégie d'alimentation se basant sur la mesure de l'oxygène dissout a été développée dans ce travail. Il a été établi qu'en passant du mode de culture «batch» au mode «fed batch », la concentration maximale de spores était augmentée de 5,6xl08 à 8,6x108 ufc/mL, alors que le potentiel entomotoxique passait de 13xl09 à 18xl09 SBU/L. L'accroissement de l'entomototoxicité en mode« fed batch» pourrait être dû à la production d'un plus grand nombre de spores et à la production de cristaux de plus grandes dimensions qui contiendraient d'avantage d'endotoxines que ceux qui sont produits en mode « batch ». 2) Le type d'agents neutralisants semble aussi avoir un effet sur le potentiel entomotoxique. L'hydroxyde d'ammonium et l'acide acétique ont été utilisés comme agents neutralisants durant la fermentation en remplacement du couple hydroxide de sodium et acide sulfurique, ce changement permettant d'accroître le potentiel entomotoxique de 22 % dans le cas des boues en provenance de la station d'épuration de la CUQS, de 21 % dans des boues de la station de JQS et de 14 % dans le milieu soja. Cette amélioration des performances du procédé résulterait de l'augmentation de sources de carbone et d'azote facilement assimilables provenant de l'addition des agents neutralisants, ce qui stimule la production d'endotoxines dans les cristaux et favorisant une meilleure maturation des spores. 3) Le pré-traitement thermo-alcalin des boues aussi permis d'améliorer les performances du procédé de production de Bt dans les boues d'épuration. L'hydrolyse de la matière organique complexe en molécules de plus petites tailles et en nutriments plus facilement assimilables par le Bt a permis d'augmenter le potentiel entomotoxique à la fin de la fermentation de 12,3xl09 SBU/L dans les boues non-traitées à 16,6x109 SBU/L dans les boues pré-traitées. Cette amélioration du potentiel entomotoxique pourrait être attribuée à un meilleur transfert d'oxygène en raison d'une diminution de la viscosité et à une amélioration de la disponibilité des nutriments. Nous avons montré qu'en dépit d'un grand nombre de spores obtenus lors de la fermentation du Bt dans le milieu traditionnel semi-synthétique à base de farine de soja, le potentiel entomotoxique dans ce dernier reste de loin inférieur à celui obtenu dans des milieux de culture à base de boues d'épuration municipales. Dans ces dernières, la synthèse du complexe spore-cristal semble être de meilleure qualité suite à une plus grande variété de nutriments présents dans les boues. De plus, il est vraisemblable que ce potentiel entomotoxique accru soit imputable à plusieurs autres facteurs biochimiques libérés lors de la lyse cellulaire et agissant sur la structure et ainsi sur la virulence des sites actifs des cristaux entomotoxiques. Finalement, nous avons mis en évidence que l'activité protéolytique augmente au cours des premières phases du processus de fermentation avec la concentration de matières en suspension dans les boues et décline après avoir atteint un maximum 36 heures environ après le début de la fermentation. Indépendamment de la concentration de matières en suspension, et jusqu'au pic, i) l'activité protéolytique croît de façon exponentielle avec le compte de cellules total, et ii) le potentiel entomotoxique augmente de façon linéaire avec l'activité protéolytique. Ces travaux ont aussi permis d'établir une relation de type exponentielle entre le potentiel entomotoxique et la concentration de spores.

Abstract

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Bt is commercially used to control insects-pests in forestry and agriculture; however, the utilisation of Bt has been restricted due to its high cost of production through fermentation. Safe and effective insects-pests control comes actually with a hefty price tag. An important aspect of cutting costs may be the substitution of high cost medium ingredients based on soy flour and fishmeal by complex, indigenous agro-industrial waste and wastewater sludge. The production of Bacillus thuringiensis var. kurstaki based biopesticides using wastewater sludge as raw material was successfully achieved in our laboratory. The optimization of different fermentation parameters, namely, temperature, pH, agitation and aeration, volume and age of inoculum, sludge suspended solids concentration, C/N ratio and various pre-treatment methods of sludge, all those factors undeniably allowed for achieving higher entomotoxicity potency in the final product. However, this improvement remains insufficient for eventual commercialization. The primary aim of our investigation was to develop a suitable technology at large scale for the production of Bt based biopesticides using wastewater sludge as a raw material. The Bt fermentation process using sludge as raw material was successfully scaled-up and resulted in high productivity for toxin protein yield and high protease activity. An improvement of 30 % of the entomotoxicity potential was obtained at pilot scale. Protease activity increased by 2 to 4 times at bench and pilot-scale, respectively, compared to the maximal activity obtained in shake flasks. The maximum protease activity was obtained in pilot scale (4.1 IU/mL) due to better oxygen transfer. By adopting various operational process strategies, entomotoxicity potency has been substantially enhanced. This improvement would compete seriously with the conventional process. 1) A simple fed batch strategy based on DO measurement during the fermentation cycle was developed in this work. It was established that while shifting the process strategy from batch to fed batch, the maximal spore concentration was increased from 5.6xl08 to 8.6x108cfu/mL and resulted in an increase of entomocidal activity from 13xl09 to 18xl09 SBU/L. It was assumed here that a large number of cells produced a correspondingly large number of spores, and consequently, a large amount of insecticidal crystal proteins 2) Ammonium hydroxide and acetic acid were used as pH control agents during Bacillus thuringiensis fermentation in a pilot scale fermentor (150L) employing two secondary wastewater sludges from two different wastewater treatment plants (CUQS and JQS) and semi-synthetic soybean meal as raw materials. Entomotoxicity potency was improved by 22 %, 21 % and 14 % in CUQS, JQS and soybean media, respectively compared to results obtained with NaOH/2-hS04 as pH control agents. This improvement in Bt process performance was a consequence of the addition of rapidly utilizable carbon and nitrogen source through pH control, which stimulated endotoxin production in the crystal and helped the spores to mature properly. 3) Specifie complex media such as sludge needs pre-treatment in order to transform less degradable compounds into more easily degradable ones. Thermo-alkaline treatment was found to be an effective process to enhance Bt process efficiency. The final entomotoxicity potency increased from 12.3xl09 SBU/L with the raw sludge to 16.6x109 SBU/L with thermo-alkaline pre-treated sludge. This enhancement in process performance could be attributed to a better oxygen transfer due to decrease in media viscosity and improvement of nutrient availability due to sludge solubilization and biodegradability after harsh thermo-alkaline treatment. Higher entomotoxicity was recorded at low spore concentration using wastewater sludge as a raw material whereas low entomotoxicity was reported at high spore concentration in synthetic medium. This enhancement in entomocidal activity could be attributed to better spore maturation in wastewater sludge and more toxic crystals than those produced in the synthetic medium. In fact, spore maturation and crystal synthesis needed a higher amino acids content and it seems that wastewater sludge provides a higher nutrient content compared to synthetic media. Finally, we showed that, maximal protease activity increased with sludge suspended solids concentration. However, it decreased after attaining a peak at about 36h. Irrespective of sludge suspended solids concentration, protease activity (until it peaked) showed an exponential relationship with total cell count and a linear relationship with entomoxicity potency. An exponential correlation was also established between spore concentration and entomotoxicity.

Type de document: Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Tyagi, Rajeshwar Dayal
Co-directeurs de mémoire/thèse: Valéro, José R.
Informations complémentaires: Résumé avec symboles
Mots-clés libres: boue d'épuration; bacillus thuringiensis; biopesticide; Bt
Centre: Centre Eau Terre Environnement
Date de dépôt: 22 juin 2012 17:27
Dernière modification: 17 mars 2016 17:39
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/423

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