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Molecular biology of single-stranded DNA viruses in shrimps and crickets

Pham, Hanh T. (2014). Molecular biology of single-stranded DNA viruses in shrimps and crickets Thèse. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Doctorat en biologie, 282 p.

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Résumé

Les virus à ADN simple brin figurent parmi les plus petits virus connus à ce jour, leur taille se situant entre 17 et 25 nm. Ils comprennent, entre autres, les membres de la famille des Parvoviridae dont le génome est un ADN linéaire et ceux de la famille des Circovoridae dont le génome est circulaire. Plusieurs de ces virus sont des agents de maladies, certaines graves, aussi bien chez l'homme que chez les animaux. Au cours des 4 dernières décennies, plusieurs nouveaux virus à ADN simple brin ont été isolés et caractérisés à partir de différents hôtes, depuis les crustacés et les insectes jusqu'aux mammifères. Récemment, l'avènement des nouvelles technologies de séquençage a permis l'identification d'un grand nombre de nouveaux virus et de leurs isolats à partir d'échantillons récoltés dans l'environnement et a révélé une très grande diversification et dispersion géographique des virus à ADN simple brin. De nombreuses études de biologie moléculaire et de structure des virions ainsi que l'analyse de leurs interactions avec leurs hôtes sont en cours pour caractériser ces virus. Toutefois, la plupart de ces études se heurtent au fait que l'on ne dispose pas de cultures cellulaires permettant leur multiplication, comme c'est le cas par exemple pour plusieurs parvovirus. Le premier objectif de notre recherche a été de décrypter la stratégie de transcription de deux parvovirus d'invertébrés, le densovirus de la crevette Penaeus stylirostris (PstDNV) et celui du grillon Acheta domesticus (AdDNV). Ces deux virus sont responsables d'importantes épizooties dans les élevages intensifs de leurs hôtes. Concernant le PstDNV, il a été identifié dans les années 1980 et a rapidement causé, au cours des trois dernières décennies des pertes importantes dans plusieurs régions d'élevage intensif à grande échelle de crevettes. Plusieurs séquences incomplètes, toutes obtenues par PCR, ont été déposées dans GenBank. Ces séquences ont montré une organisation des régions codantes de type monosens, semblable à celle connue de certains densovirus de moustiques appartenant au genre Brevidensovirus. Toutes ces séquences sont caractérisées par l'absence d'extrémités palindromiques, ce qui est la règle chez tous les autres parvovirus. Par suite de la faible teneur en virus des échantillons dont nous disposions et le fait que les particules virales renferment essentiellement des brins de polarité négative, le clonage d'une séquence complète infectieuse d'ADN bicaténaire du génome du PstDNV est un véritable défi qui n'a pas encore été surmonté à ce jour. De même, les nombreux essais dans plusieurs laboratoires d'établir des cultures primaires ou une lignée cellulaire de crustacé pour xiii multiplier ce virus ont tous échoué jusqu'à présent. En dépit de ces difficultés nous avons réussi à décrypter la stratégie d'expression du PstDNV en transfectant la lignée cellulaire C6/36 de moustique et en utilisant un système d'expression baculovirus. Nous avons étudié en parallèle les modalités de transcription du densovirus d'Aedes albopictus, un virus pathogène des larves de ce diptère et qui infecte chroniquement certaines souches de la lignée C6/36. Ces deux virus ont été classés dans le même genre Brevidensovirus de la sous-famille des Densovirinae. Toutefois, nos résultats ont mis en évidence des différences significatives entre ces deux virus. Le PstDNV utilise un promoteur spécifique et un épissage pour l'expression de la protéine de réplication NS1 et un deuxième promoteur localisé dans l'intron de NS1 pour exprimer la protéine NS2. Par contre, l'expression des deux protéines NS de I'AaiDNV est sous le contrôle de deux promoteurs se chevauchant et NS2 est traduit par un mécanisme de «leaky scanning». A notre avis, ces différences justifient la classification du PstDNV dans un nouveau genre. Le deuxième objectif était l'analyse geographique et la stratégie de l'expression de l'Acheta domesticus densovirus (AdDNV). L'AdDNV a été découvert il y a plus de 30 ans mais n'a été caractérisé que récemment, suite à des épidémies foudroyantes dans les élevages en masse de son hôte en Amérique du Nord. Le génome complet de I'AdDNV a été cloné et séquencé et sa stratégie d'expression s'est révélée unique, suggérant qu'il correspond à un nouveau type au sein du groupe des densovirus ambisens. L'épissage différentiel des messagers NS génère 3 protéines non structurales NS1, NS2 et NS3. Les séquences codantes des protéines structurales sont portées par deux cadres de lecture (ORFs), I'ORF-A et I'ORF-B. L'ORF-A code la protéine majeure VP2 et, par un épissage éliminant la région N-terrninale de VP2 et mettant en phase les deux ORFs, les protéines VP1, VP3 et VP4 sont produites. La séquence N-terminale de VP1 contient le motif phospholipase de type A2 requis pour dégrader la membrane endosomiale au moment de l'entrée du virus. Par la suite, le même type d'organisation génomique et d'expression a été démontré pour le densovirus BgDNV de blatte. Nous avons réalisé le clonage et le séquençage complet de huit isolats d'AdDNV à partir de cadavres d'Acheta domesticus et de Gryllus sigil/atus récoltés au cours de pandémies en Europe, au Canada, aux États-Unis et au Japon. Les analyses phylogénétiques ont montré que les virus responsables d'épizooties dévastatrices en 2009- 201 0 en Europe et en Amérique du Nord sont fortement apparentés et ont divergé vers 2006. Le virus responsable de l'épizootie survenue au Japon à la même époque a divergé xiv vraisemblablement il y a beaucoup plus longtemps, ce qui suggère que différents facteurs ont contribué à l'apparition de ces pandémies. Comme celui des autres densovirus, le génome du PstDNV doit posséder à chaque extrémité une séquence palindromique nécessaire pour la réplication de l'ADN sur le modèle du cercle roulant (RCR). Ce virus est connu depuis plus de 40 ans et la structure des séquences terminales de son génome restent une énigme. Le clonage et le séquençage des extrémités des génomes de parvovirus se sont toujours avérés difficiles à cause de leur forte teneur en GC rendant très stables les structures terminales en épingle à cheveux et, également, du fait de l'encapsidation majoritaire de brins négatifs. Tel est le cas, par exemple pour celles du parvovirus humain 819 dont la séquence de ses extrémités n'a été obtenue que 19 ans après sa découverte. Notre troisième objectif a été de résoudre ces problèmes. La méthode que nous avons utilisée pour séquencer les extrémités du génome du PstDNV est la même que celle qui a été utilisée pour les extrémités des densovirus PiDNV et JcDNV dans notre laboratoire. A notre grande surprise, aucune structure en épingle à cheveux n'a été trouvée, mais seulement des répétitions directes aux deux extrémités qui permettent de proposer un nouveau modèle de réplication. Nous proposons donc une nouvelle classification pour ce virus. L'absence d'AdDNV dans plusieurs échantillons de grillons provenant d'élevages à taux de mortalité élevé nous a conduit à rechercher et à découvrir de nouveaux types de virus à ADN simple brin linéaire ou circulaire. La quatrième partie de cette thèse est consacrée à la présentation de ces nouveaux types de virus infectant différentes espèces de grillons. Nous avons découvert deux nouveaux densovirus chez l'Acheta domesticus nommés; Acheta domesticus mini-ambisens densovirus (AdMADV) et Acheta domesticus segmented densovirus (AdSDNV). En outre, et pour la première fois, nous avons identifié un nouveau virus à ADN circulaire que nous avons appelé Acheta domesticus volvovirus (AdVVV) et il a été identifié à partir de grillons de différentes espèces d'Amérique du Nord et du Japon. Ces virus ne présentent aucune séquence d'homologie avec aucuns des génomes viraux déposés dans GenBank. L'AdMADV a un petit génome ambisens de 4945 nt et a des «lnverted terminal repeats» (ITRs) de 199 nt qui constituent une structure en épingle à cheveux en forme d'Y dans ses télomères. En général, l'organisation du génome de ce virus a été trouvée comparable à celle d'autres membres du genre Densovirus. Le deuxième densovirus; AdSDNV, possède une propriété unique qui n'a pas été retrouvée chez les autres Densovirus typiques; la région non-structurale complète de 3234 est couverte par les xv deux télomères en forme de T. De plus, le gène VP n'y a pas été détecté. Nous supposons qu'il y a peut-être un fragment codant pour le VP qui est séparé du NS. Une autre possibilité qui peut être prise en compte est que ce virus pourrait utiliser la capside d'autres virus, probablement celle d'AdVVV, car, nous avons remarqué que les grillons infectés par I'AdSDNV étaient positifs à I'AdVVV par PCR. Des génomes viraux à ADN circulaire ont également été clonés et séquencés à partir de la crevette Penaeus monodon. Ces virus ont des génomes de tailles diverses allant de 1777 (PmCV-1) et 1788 (PmaCV-2) nts possédant au moins deux cadres de lecture. L'ORF Rep de PmCV-1 codant la protéine de réplication représente 90% d'identité et 30% de couverture avec les cyclovirus en général et le circovirus du copépode Labidocera aestiva en particulier. Ainsi, nos résultats confirment l'évolution rapide et l'expansion de ces groupes de virus à ADN simple brin chez les invertébrés.

Abstract

Single-stranded DNA viruses are among the smallest viruses, ranging from 17 to 25 nm in diameter. They include, among others, members of the Parvoviridae family with linear DNA genomes and the Circoviridae family with circular single-stranded DNA (ssDNA viruses). Many of these viruses have been found to be serious animal and human pathogens. ln the past 40 years, numerous novel ssDNA viruses have been discovered and characterized from different hosts such as crustaceans, insects, and mammals. Recently, large numbers of new viruses and their isolates have been identified, especially with the advent of next-generation (deep) sequencing of environmental samples, revealing a rapid evolution rate and widespread occurrence of ssDNA viruses. Many studies on the molecular biology, viral structure, and host interaction of ssDNA viruses are in progress. However, most of these studies are very challenging since these viruses generally lack a oeil culture system for their in vitro propagation, particularly for parvoviruses. The first objective of our current study focused on the transcription strategy of two tentative members of Brevidensovirus genus: Penaeus stylirostris densovirus (PstDNV) and Aedes a/bopictus densovirus (AaiDNV). PstDNV was a monosense densovirus first identified in the 1980s. lt caused significant, global economie losses during the last decades. Severa! incomplete PstDNV sequences deposited on Genbank were ali derived from PCR amplification. However, those sequences still lack both palindromic extremities that are a hallmark of ali parvovirus genomes. According to our experience, due to the low viral content of infected shrimps and the negative strandedness of the viral encapsidated DNA, obtaining infectious clones from native virus is extremely challenging. Therefore, complete PstDNV genome has not been achieved yet. During the past 30 years, despite efforts from scientists from ali over the world and large investments, routinely useful primary oeil cultures or oeil lines of shrimp or other crustaceans (crab, lobster, and crayfish) have not been successfully developed. ln this thesis, the expression strategy of PstDNV was successfully explored and confirmed via non-host cell line C6/36 and baculovirus system. As a comparison, we also studied the transcription map of Aedes a/bopictus densovirus (AaiDNV), a chronic pathogen for Aedes albopictus larvae. These two viruses were classified into the same genus, Brevidensovirus, a rarely studied genus in the Densovirinae subfamily, Parvoviridae family. Our results showed quite different characteristics in their expression: PstDNV employed a x splicing mechanism for NS1 and two distant promoters (the NS2 promoter is located in the intron of NS1) for NS proteins instead of a leaky scanning and two overlapping promoters in AaiDNV. This indicated that PstDNV should be classified in a separate genus. The second objective was the geographycal analysis and the expression strategy of Acheta domesticus densovirus (AdDNV). This virus has been an epidemie pathogen for cultured house crickets in Europe but only became to a full-blown epidemie in Europe and North America in 2009-201 O. AdDNV is an ambisense virus and was discovered more than 30 years ago. lt was not further studied until recently, when devastating pandemies necessitated its characterization. lts complete genome has been cloned, sequenoed and its unique expression strategy has been studied. AdDNV revealed unusual splicing features, suggesting a new genus Pefudensovirus within the ambisense densovirus group. 8oth NS and VP mRNA were spliced. Splicing in NS mRNA resulted in a set of three non-structural proteins NS1, NS2, and NS3. For the VP gene, there were two ORFs, ORF-A, which coded for VP2, and ORF-8. Connecting the two ORFs via splicing resulted in the removal of the N terminus of VP2 and three VP proteins, VP1, VP3, and VP4, were then produoed. The Nterminal extension of VP1 contained a phospholipase A2 (PLA2) motif required to breach the endosomal membrane during oeil entry. Subsequently, Blatte/la germanica densovirus (8gDNV) was shown to share similar characteristies in genome organization and gene expression. Eight AdDNV isolates from different epidemies in Europe, Japan, and North America, from different hosts, Acheta domesticus and Gryl/odes sigillatus, were cloned and sequenced. Phylogenetic analysis revealed that the virus responsible for the devastating outbreaks in 2009/2010 in Europe and North America were closely related and diverged around 2006. However, the virus responsible for the outbreak at the same time in Japan diverged probably much earlier suggesting other contributing factors in these pandemies. As for other parvoviruses, the PstDNV genome should contain terminal hairpins essential for viral DNA replication by a rolling circle mechanism. lt has been 40 years sinoe the first report of this virus appeared, and its extremities are stiJl a mystery. Cloning and sequencing of parvovirus ends are challenging tasks due to their highly stable hairpin structures, high GC content or genome packaging of minus rather than both strands. For the human 819 parvovirus, for example, the terminal sequences were solved only 19 years after it had been discovered and the main part of the genome had been sequenoed. Our third objective was directed towards these problems. We developed a promising method, using xi Pseudop/usia includens densovirus (PiDNV) and Junonia coenia densovirus (JcDNV) models, that could resolve the difficulties in the amplification and sequencing of the extremities. No hairpins were found by analyzing the extremities of PstDNV, but direct terminal repeats (DTRs) were found at both ends th at cou Id be essential in a novel replication moder. Therefore, we propose a new classification for these two viruses. ln attempts to identify infectious agents, which caused high mortality rates in AdDNVnegative Acheta domesticus crickets, we discovered novel linear and circular ssDNA viruses. The fourth part of this thesis is focused on these new ssDNA viruses that infect different cricket species. We discovered two new densoviruses in A. domesticus, named Acheta domesticus mini ambisense densovirus (AdMADV) and Acheta domesticus segmented densovirus (AdSDNV). ln addition, for the first time, a new circular DNA virus, named Acheta domesticus volvovirus (AdVVV), was discovered in different cricket species in North America and Japan. These viral genomes displayed no nucleotide sequence identity to any virus deposited in GenBank. AdMADV has a small ambisense genome size of 4945 nts and the related 199 nt-ITRs that fold into Y -shaped hairpin structure at both telomeres. Overall genome organization of this virus was found similar to that of other members of Densovirus genus. The second densovirus AdSDNV has an unusual property that made it differs from other typical densoviruses; the complete non-structural coding region of 3234 is flanked by two T-shaped telomeres. Because no VP gene was detected, we assume that there may be a VP- coding fragment separated from NSs. First circular Rep-encoding ssDNA (CRESS-DNA) viruses (CVs) were also detected and cloned from PstDNV-infected Penaeus monodon. These viruses have small but diverse genome sizes, 1788 (Pm-associated CV or PmaCV-2) and 1777 (PmCV-1) nts containing two main ORFs. The Rep-coding ORF of PmCV-1 shared 30% identity at 90% coverage with that of cycloviruses and copepod Labidocera aestiva circovirus. Our results confirmed the rapid and widespread evolution of this ssDNA virus group.

Type de document: Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Tijssen, Peter
Co-directeurs de mémoire/thèse: Bergoin, Max (Université Montpellier Il, France)
Mots-clés libres: crevette ; grillon ; densovirus ; biologie moleculaire
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 17 mars 2016 20:29
Dernière modification: 11 janv. 2017 18:56
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/3350

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