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Inhibition de la croissance de Candida Krusei et évaluation du profil nutritionnel de la fermentation de Saccharomyces unispora à partir du lactoserum.

Bhattacharya, Indrani (2015). Inhibition de la croissance de Candida Krusei et évaluation du profil nutritionnel de la fermentation de Saccharomyces unispora à partir du lactoserum. Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en sciences de l'eau.

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Résumé

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Le lactosérum provenant de la fabrication du fromage est considéré comme une importante source de pollution de l’environnement, car il cause une demande chimique en oxygène (DCO) supérieure à 60 000 mg⁄L et une demande biochimique en oxygène (DBO) supérieure à 30 000 mg⁄L. Environ 35 % du lactosérum pourrait servir dans l’alimentation humaine et animale puisque celui-ci contient la moitié des nutriments présents dans le lait. Les autres utilisations du lactosérum sont la production de boissons riches en protéines, par exemple les boissons protéinées, le lait fermenté et les suppléments de protéines. Le lactosérum peut même être utilisé comme engrais en agriculture. Le lactose dans le lactosérum est la source principale de DCO et le retrait des protéines du lactosérum réduit la DCO de 10 000 mg⁄L. Le lactosérum contient également quelques métaux lourds (Al, Cd et Pb) en faibles concentrations. Des techniques de filtration et d’ultrafiltration, par exemple, sont utilisées pour convertir les protéines du lactosérum en une forme plus concentrée permettant de récupérer jusqu’à 50 % des protéines (sous la forme de perméat de lactosérum). Ces concentrés protéiques sont une option économique pour la production de protéines d'organismes unicellulaires (POU). Cela permet de réduire la pollution et résout en grande partie le problème de gestion des déchets. Les POU pourraient permettre de nourrir à bon marché une population mondiale en forte croissance. La production de protéines microbiennes n’est pas contrainte par les conditions environnementales. Cependant, le choix des microorganismes est important pour la production de POU, car les microbes doivent pouvoir obtenir du lactosérum les nutriments nécessaires au maintien des fonctions de leurs cellules. Le choix de la communauté microbienne est aussi basé sur certains critères de sécurité, la communauté microbienne ne doit pas altérer les propriétés fonctionnelles de la nourriture à laquelle on l’ajoute, les microbes ne doivent pas être pathogènes, etc. Ainsi, le but de cette étude était de produire des aliments destinés aux humains et aux animaux avec des microbes autorisés, en l’absence de microbes non désirés, et d’en examiner le profil nutritif dans des monocultures et des cultures mixtes. La fermentation du lactosérum a été effectuée à pH 3,5 et à 40 °C avec Kluyveromyces marxianus, Candida krusei est alors ressorti comme un contaminant biologique. Les méthodes utilisées pour éliminer C. krusei comprenaient des approches chimiques, biochimiques et à l’aide de bionanoparticules. Les approches chimiques et biochimiques étaient efficaces pour inhiber C. krusei, mais K. marxianus était également affecté. De plus, les approches chimiques et biochimiques n'étaient pas très économiques pour la fermentation à grande échelle. Des approches d'inhibition sélective ont été comparées et il a été observé que 350 μM d’une protéine tueuse conjuguée à de l’argent (Ag-KT4561) d’une taille de 200 nm pourrait complètement éliminer C. krusei en affectant seulement partiellement K. marxianus et Saccharomyces unispora à pH 5,5 et à 30 °C. On a même observé que K. marxianus avait un meilleur profil de croissance à pH 5,5 plutôt que 3,5. La concentration de l'ion métallique d’argent a été calculée à 3,96 mM et la stabilité du complexe protéine-argent a été vérifiée sur plus de 20 semaines. Le complexe protéine-argent n'a pas formé de complexes métalliques avec les minéraux présents dans le lactosérum et, par conséquent, il est considéré comme un composé stable. Puisque l'argent est fortement antimicrobien, l'utilisation d'Ag-KT4561 peut éliminer d'autres contaminants biologiques et contribuer à ce que la fermentation s’effectue en conditions aseptiques. Cependant, les ions d’argent affectaient partiellement K. marxianus, mais dans une faible mesure. Le profil nutritif de S. unisporus a été étudié en faisant varier la source de carbone (sucrose, glycérol), d’azote (urée, sulfate d'ammonium) et le pH. S. unisporus est considéré comme une levure probiotique parce qu'il produit des intermédiaires nutritifs. S. unisporus pouvait consommer une vaste gamme de sources de carbone excluant le lactose et il pouvait consommer 0,4 % (poids/volume) de sulfate d'ammonium comme source d'azote. S. unisporus s'est avéré strictement urée négatif. La monoculture de S. unisporus était enrichie en lysine (84,0 mg/g), valine (74,4 mg/g), acide aspartique (83,3 mg/g) et glycine (77,0 mg/g). La biomasse de S. unisporus contenait les minéraux essentiels, incluant Ca, S, Na, Mg, P et K. La teneur en acides gras observée pour S. unisporus était de 0,86 % (poids/poids) et en protéines de 4.2 (g/L). Le pH idéal pour la production de POU avec S. unisporus en monoculture était de 5,5. L'hydrolyse acide du lactosérum et du perméat a été réalisée et S. unisporus a été cultivé en monoculture et en culture mixte avec K. marxianus. Il a été observé que 0,2 % (p/p) de H2SO4 pouvait hydrolyser le perméat de lactosérum et 90 % du lactose était converti en glucose et en galactose en 70 min. Alors que 0,4 % (p/p) de H2SO4 permettait de convertir le lactose en glucose et en galactose en 60 min. S. unisporus et K. marxianus ont été cultivés dans du lactosérum hydrolysé avec 0,4 % (p/v) de sulfate d'ammonium et une meilleure croissance a été observée pour K. marxianus (7,8 x 108 CFU/mL) que pour S. unisporus (5,6 x 107 CFU/mL), parce que ce dernier peut consommer partiellement le galactose tandis que K. marxianus peut consommer autant les monosaccharides que le surplus de lactose. La fermentation en culture mixte (S. unisporus et K. marxianus) montrait une légère augmentation de la teneur en acides aminés essentiels, en particulier la leucine et l'isoleucine (79,9 mg/g), tandis que pour la biomasse de S. unisporus en monoculture, une concentration de seulement 59 mg/g a été mesurée. Il a même été observé que la production de biomasse en culture mixte générait des intermédiaires (furanméthanol, formate furfurylique, acides organiques faibles) importants en biotechnologies. Cependant, aucune quantification n'a été effectuée. En vue de la production d’aliments pour les humains et les animaux, le contaminant biologique a été éliminé et la levure autorisée a été ajoutée. C. krusei a été tué grâce à cette approche de synthèse verte rentable en maintenant les conditions de fermentation à pH 5,5 avec une température de 30 °C et à l’aide de l’agent biologique de conservation Ag-KT4561. Après l’élimination de C. krusei, la levure autorisée S. unisporus a été ajoutée dans la fermentation en monoculture et en culture mixte. La qualité des POU en termes de valeur nutritive était augmentée lorsque S. unisporus était cultivé avec K. marxianus dans du lactosérum et du perméat. Par conséquent, sur la base de ces deux études, il est possible de conclure que le contaminant biologique (C. krusei) peut être éliminé de façon aseptique dans des fermentations en culture mixte par une approche rentable de chimie verte. .

Abstract

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Cheese whey is considered as a significant source of environmental pollution as the chemical oxygen demand (COD) is greater than 60, 000 ppm and biological oxygen demand (BOD) is greater than 30, 000 ppm. Approximately 35% of the cheese whey is considered for food and feed because cheese whey consists of half of the nutrients, which are present in milk. The other uses of cheese whey are by the production of beverages, which are rich in proteins for example protein drinks, fermented milk, and sports protein. Cheese whey is also utilized in agriculture as a fertilizer. The major source of high COD is the presence of lactose in cheese whey and it has been observed that the removal of proteins from cheese whey reduces the COD by 10, 000 ppm. Cheese whey contains some heavy metals (Al, Cd, and Pb) in lower quantities. Techniques such as filtration and ultra-filtration are utilized for the conversion of whey protein into more concentrated form leading up to 50% of protein recovery (as whey permeate). These protein concentrates are used in single cell protein production (SCP) as an economic alternative. This helps in controlling the pollution and solves the waste disposal problem to a larger extent. SCP can feed the ever-increasing world population at much cheaper rates. Microbial protein can be an alternative source, which can be grown in a any surface area irrespective of the environmental conditions. However for the production of SCP, right choice of microorganisms is important, as microbe must be able to derive nutrients from cheese whey for maintaining the cell functions. Additionally, the choice of the microbial community is based on certain criteria such as general safety from the microbe, the microbial community must not alter the functional properties of food to which it is added, the microbe must not be pathogenic in nature etc. Based on this, the aim of the study was the production of food and feed by eliminating the unwanted microbe, addition of the acceptable microbe, study of the nutritive profile in a mono and mixed culture. Cheese whey fermentation was carried out at pH 3.5 and 40 °C with K. marxianus but C. krusei was emerging as a biological contaminant. The methods applied for the removal of C. krusei were chemical, biochemical and bio-nanoparticle approaches. Chemical and biochemical approaches were effective in inhibiting C. krusei but K. marxianus was also getting affected. However chemical and biochemical approaches were not very economical for large-scale fermentation. Selective inhibition approaches were compared and it was observed that 350 uM of silver-killer protein conjugate (Ag-KT4561) of size 200 nm could eliminate C. krusei completely with partial effect on K. marxianus and S. unisporus at pH 5.5 and 30 °C. It was also observed that K. marxianus has a better growth profile at pH 5.5 rather than in pH 3.5. The concentration of the metallic silver ion is calculated as 3.96 mM and stability of the silver-protein complex were verified for more than 20 weeks. The silver-protein complex did not form any metallo-complex with minerals present in cheese whey and hence it is a stable compound. As silver is highly antimicrobial, usage of Ag-KT4561 can eliminate other biological contaminants and help run the fermentation under aseptic conditions. However silver ions had partial effect on K. marxianus but not to a larger extent. A study was conducted for the nutritive profile of S. unisporus by varying the carbon (sucrose, glycerol), nitrogen source (urea and ammonium sulphate) and pH. S. unisporus is coined as a probiotic yeast because it generates nutritive intermediates. S. unisporus could consume vast range of carbon sources excluding lactose and 0.4% (w/v) of ammonium sulphate as nitrogen source. S. unisporus was found to be strictly urea-negative. The mono-culture of S. unisporus was found enriched in lysine (84.0 mg/g), valine (74.4 mg/g), asparatic acid (83.3 mg/g) and glycine (77.0 mg/g). The S. unisporus biomass had the essential minerals including Ca, S, Na, Mg, P and K. The fatty acid content observed for S. unisporus were 0.86% (w/w) and protein content of 4.2 (g/L). The ideal pH of S. unisporus for SCP production as a mono-culture was observed at 5.5. Further acid hydrolysis of cheese whey and permeate were performed and S. unisporus was grown as mono-culture and mixed culture with K. marxianus. It was observed that 0.2% (w/w) of H2SO4 can perform hydrolysis of whey permeate with 90% lactose converted to glucose and galactose in 70 min. However 0.4% (w/w) of H2SO4 converted lactose from cheese whey into glucose and galactose in 60 min. S. unisporus and K. marxianus were grown in hydrolyzed whey along with 0.4% (w/v) of ammonium sulphate and it was observed that K. marxianus (7.8 x 108 CFU/mL) has better growth than S. unisporus (5.6 x 107 CFU/mL) because S. unisporus can partially consume galactose whereas K. marxianus can consume both the monosaccharides and the left over lactose. Eventually, fermentation with the mixed culture (S. unisporus and K. marxianus) has shown slight increment in the essential amino acid content especially with leucine and isoleucine (79.9 mg/g), whereas in the case of mono-culture S. unisporus biomass of only 59 mg/g was observed. It was also observed that mixed culture biomass production generated intermediates (furanmethanol, furfuryl formate, weak organic acids), which have biotechnological importance. However no quantification has been performed. Therefore for the production of food and feed, elimination of the biological contaminant was performed followed by addition of the acceptable yeast. C. krusei was killed in an economic and green synthesis approach by maintaining the fermentation conditions at pH 5.5 and temperature 30 °C with the help of bio preservative Ag-KT4561. After the removal of C. krusei, S. unisporus was added as acceptable yeast in mono-culture fermentation and in mixed-culture fermentation. S. unisporus has enhanced SCP quality in terms of nutritive value when grown along with K. marxianus in cheese whey and permeate. Therefore based on these two set of studies it is concluded that biological contaminant (C. krusei) can be removed aseptically in mixed culture fermentations in an economical green chemistry approach.

Type de document: Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Tyagi, Rajeshwar Dayal
Informations complémentaires: Résumé avec symboles
Mots-clés libres: lactosérum ; contaminant biologique; C. krusei; S. unisporus ; protéines d'organismes unicellulaires; POU; fermentation
Centre: Centre Eau Terre Environnement
Date de dépôt: 29 mars 2016 21:15
Dernière modification: 30 mars 2016 13:00
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/3339

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