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Turnip mosaic virus membrane-associated replication complexes- ultrastructure and role in virus movement

Wan, Juan (2015). Turnip mosaic virus membrane-associated replication complexes- ultrastructure and role in virus movement Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 225 p.

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Résumé

Les virus à ARN positifs [ARN(+)] remanient les membranes cellulaires pour faciliter la réplication de leur ARN viral (ARNv). Les complexes ribonucléoprotéiques viraux (RNPv) formés d'ARNv et de protéines du virus et de l’hôte sont associés aux membranes et se déplacent au travers des plasmodesmes (PD) pour atteindre les cellules avoisinantes. Une fois arrivé dans la nouvelle cellule, un nouveau cycle de synthèse d'ARNv est initié. Ces complexes RNPv peuvent à leur tour atteindre les tissus vasculaires et entreprendre leur déplacement sur une longue distance. Un nouveau concept émerge dans la communauté scientifique. Il consiste à considérer que la réplication de l'ARNv et le mouvement viral sont deux processus étroitement liés. Cependant, la nature du complexe RNPv demande encore à être définie. La présente thèse se concentre sur l'étude des complexes associés aux membranes induits par le virus de la mosaïque du navet (Turnip mosaic virus, TuMV). Le TuMV est un virus à ARN (+) appartenant au genre viral Potyvirus. Ce dernier représente le plus grand genre des virus de plante. Ils sont responsables de plus de la moitié des pertes agricoles imputées aux virus. La protéine virale 6K2 est membranaire et est responsable de la réorganisation du système endomembranaire pour former des vésicules mobiles. Ces dernières contiennent les complexes de réplication virale. Les complexes du TuMV associés aux membranes ont été largement étudiés par microscopie confocale essentiellement dans les cellules épidermiques. Les deux objectifs de cette thèse ont été d'une part d'analyser la présence de complexes de réplication du TuMV associés aux membranes dans les tissus vasculaires et d'autre part de découvrir en détails l’ultrastructure de ces complexes dans plusieurs types cellulaires. Le premier objectif a consisté à observer la présence de complexes de réplication associés aux membranes dans tous les types cellulaires présents dans les feuilles et les tiges de la plante. En faisant des coupes cryohistologiques, suivies d'immuno-histolocalisations par microscopie confocale, il a pu être montré que les complexes de réplication associés aux membranes et induits par la protéine 6K2 étaient présents dans tous les types cellulaires y compris les tissus vasculaires tels que les tubes criblés du phloème et dans les vaisseaux du xylème. Des observations par microscopie électronique à transmission (MET) ont permis de montrer la présence de vésicules contenant l'ARNv en association avec des particules virales dans les vaisseaux du xylème. En menant des expériences de "girdling" sur tiges, où toutes les cellules meurent tout en maintenant l'intégrité des vaisseaux du xylème, il a été confirmé que le TuMV utilise les vaisseaux du xylème pour son infection systémique. Finalement, il a été démontré que des complexes RNPv du Potato virus X (PVX) associés à des membranes étaient aussi présents dans le phloème et le xylème de plantes infectées par ce virus. Ces études indiquent que les usines de réplication virale peuvent se retrouver dans le phloème et le xylème, suggérant ainsi que la réplication virale et le mouvement à longue distance sont deux évènements étroitement liés. Le second objectif a été dedéfinir par MET l'ultrastructure des réorganisations cellulaires induites par le TuMV. Une cinétique a été effectuée pour analyser le remodelage membranaire induit par le TuMV. À des étapes précoces de l'infection, il a été observé des amas de membranes ["convoluted membranes", (CM)] dérivant du réticulum endoplasmique rugueux (RER). À des étapes intermédiaires de l'infection, des vésicules à simple membrane (SMV) étaient observables. À des étapes plus tardives de l'infection, en plus d'agrégats de SMVs, des vésicules à double membrane (DMV) au coeur dense aux électrons étaient observables à proximité de corps denses aux électrons. Ensuite il a été montré par immuno-MET que les vésicules induites par le TuMV contenaient la protéine virale 6K2 et que seules les SMV constituaient les sites de réplication de l'ARNv. À des étapes tardives de l'infection, il a été aussi observé des corps dense aux électrons à proximité d’agglomérats de particules virales du TuMV qui pourraient être le site de leur assemblage. Par ailleurs, il a été aussi effectué de la tomographie électronique (TE) pour révéler en 3 dimensions (3D) l'accumulation de particules virales en association avec le tonoplaste dans la vacuole centrale. Ces résultats contribuent d'une part à une meilleure compréhension de la nature des complexes RNPv impliqués dans le mouvement viral sur une longue distance et d'autre part, à avoir une vision plus fine de ce que sont les sites de réplication de l'ARNv du TuMV, ainsi que des sites d'assemblage et d'accumulation des particules virales.

Abstract

Positive-strand RNA [(+) RNA] viruses remodel cellular membranes to facilitate viral RNA (vRNA) replication. Membrane-bound progeny viral ribonucleoprotein (vRNP) complexes then move through plasmodesmata (PDs) to adjacent cells to initiate new rounds of vRNA synthesis. These complexes ultimately reach the vascular tissues and are loaded into the vascular conducting tubes for long-distance trafficking. An emerging concept is that vRNA replication and movement are tightly linked processes. The moving vRNP complex, however, has yet to be defined. This thesis focuses on Turnip mosaic virus (TuMV) -induced membraneassociated complexes. TuMV is a (+) RNA virus belonging to the genus Potyvirus, which is the largest genus of plant viruses, and is responsible for more than half of the viral crop damage in the world. The viral membrane protein 6K2 is responsible for membrane reorganization that leads to the formation of motile vesicles. These vesicles contain virus replication complexes. TuMV membrane-associated replication complexes dynamics have been widely studied by confocal microscopy in epidermal cells. The two aims of this thesis were to investigate the presence of TuMV membraneassociated replication complexes in vascular tissues, and then to uncover the ultrastructure of the TuMV-induced membrane reorganization. The first research objective consisted of looking at the presence of TuMV membrane-associated replication complexes in all types of plant leaf and stem cells. By using cryohistological preparation, immunohistolocalization and confocal microscopy, it was shown that 6K2-tagged membrane-associated replication complexes were present in all cell types, including the vascular conducting tubes, which were phloem sieve elements and xylem vessels. Transmission electron microcopy (TEM) observation results showed the presence of vRNA-containing vesicles that were associated with viral particles in xylem vessels. Then the stem girdling experiments confirmed that TuMV could establish a systemic infection of the plant by going through xylem vessels. Finally, the presence of membrane-associated vRNP complexes was also demonstrated in the phloem and xylem of Potato virus X (PVX) infected plants. v Collectively, these studies indicate that viral replication factories could end up in the phloem and the xylem, suggesting that virus replication and long-distance trafficking are linked events. The second objective was to define the ultrastructure of TuMV-induced cellular reorganization by TEM. A time course analysis of TuMV-induced membrane remodeling was initially performed. Early during infection, rough endoplasmic reticulum (ER)-connected convoluted membrane (CM) structures were observed. Single-membrane vesicles (SMVs) were found at the mid stage of infection, while mixed aggregates containing SMVs, doublemembrane vesicles (DMVs) with an electron-dense core, and electron-dense bodies were detected at a late stage of infection. Then the immuno-EM experiments showed that the vesicles are tagged with 6K2, and that only SMVs are the vRNA replication sites. I also observed electron-dense bodies associated TuMV particle bundles, which probably are the particle assembly site. Finally, with electron tomography (ET), it was shown that viral particles accumulating in the central vacuole as membrane-associated complexes. Taken together, this work contributed to a better understanding of the nature of vRNP complexes for virus long-distance trafficking, of the ultrastructure of TuMV RNA replication sites, as well as particles assembly and accumulation sites.

Type de document: Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Laliberté, Jean-François
Mots-clés libres: mosaique ; navet ; tumv
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 07 mars 2016 20:36
Dernière modification: 07 mars 2016 20:36
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/3293

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