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Étude et évolution de la dioxygénase du biphényle par recombinaison aléatoire In Vitro

Vézina, Julie (2009). Étude et évolution de la dioxygénase du biphényle par recombinaison aléatoire In Vitro Thèse. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Doctorat en biologie, 181 p.

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Résumé

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Les biphényles polychlorés (BPC) sont des composés aromatiques classés comme polluants organiques persistants. La dégradation des BPC en chlorobenzoates, premier segment de la minéralisation, suit une voie oxydative de 4 étapes dont la première est catalysée par la dioxygénase du biphényle (BPDO). Cette enzyme catalyse l'hydroxylation de deux atomes de carbone adjacents situés sur l'un des cycles du biphényle. Cependant, les différentes BPDO retrouvées dans la nature ne peuvent dégrader qu'une fraction des 209 congénères BPC existants. Des études ont démontré que la spécificité de la BPDO est déterminée en partie par des segments de la portion C­ terminale de la sous-unité a (BphA) de la composante catalytique de l'enzyme (BphAE). Le projet consistait dans un premier temps à examiner la diversité des séquences d'acides aminés contenues dans les. sols et codant pour la partie C-terminale de BphA. Des séquences hautement conservées de ce fragment ont servi d'amorces pour amplifier cette partie du gène par PCR. Cet ADN permettait d'examiner des gènes de bactéries non cultivables en laboratoire et d'isolats bactériens dont les gènes bphA n'avaient pas été caractérisés. La seconde partie du projet visait à modifier génétiquement BphA afin d'obtenir des enzymes recombinantes présentant un potentiel catalytique accru ou une régiospécificité nouvelle. Un protocole d'évolution moléculaire par recombinaison aléatoire in vitro (family DNA shuffling) utilisant des fragments du gène bphA amplifiés par PCR sur l'ADN isolé directement à partir d'échantillons de sols contaminés par les BPC a été mis au point afin d'exploiter le bagage génétique des bactéries non cultivables du sol. L'analyse des séquences en acides aminés des fragments d'ADN obtenus révèle que certaines BphA contenues dans les sols divergent des familles phylogéniques ptésentes chez les isolats bactériens. Ces BphA forment une nouvelle branche phylogénique entre la famille 1 des protéobactéries (famille des souches Bulkholderia xenovorans LB400 et Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707) et la famille II des protéobactéries (famille de la souche Pandoraea pnomenusa B356). Cependant, les séquences des régions particulièrement importantes au niveau de la spécificité de l'enzyme sont similaires à celles de la souche P. pseudoalcaligenes KF101 et présentent peu de variations. Aucune des BphA recombinantes obtenues par family shuffling ne démontre un potentiel catalytique envers les BPC qui soit supérieur aux BphA déjà décrites dans la littérature. Cependant certaines révèlent un angle d'attaque en position 5,6 du noyau biphényle différent de ceux connus chez les souches isolées en laboratoire. De plus, contrairement aux autres variants sélectionnés, le variant S100 n'a conservé que ce seul angle et acquis une activité spécifique accrue envers le biphényle. La mutagenèse dirigée effectuée sur les variants cible certains résidus dont M2378238 et S283 pouvant être impliqués au niveau de la capacité du variant S100 à métaboliser les congénères ortho­-substitués. Cependant, ces résidus ne semblent pas influencer la régiospécificité envers le 2,2'-CB. Le variant S100 attaque aussi les composés monoaromatiques comme le toluène et le benzène, une capacité quasi nulle chez la BPDO de la souche parentale LB400.

Type de document: Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Sylvestre, Michel
Informations complémentaires: Résumé avec symboles
Mots-clés libres: bcp ; polychlore ; bacterie ; moleculaire
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 11 févr. 2013 19:19
Dernière modification: 16 nov. 2015 21:49
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/308

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