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Marquage régio-spécifique des récepteurs ETa et ETb de l'endothéline à l'aide de sondes peptidiques photosensibles

Tessier, Sophie (2005). Marquage régio-spécifique des récepteurs ETa et ETb de l'endothéline à l'aide de sondes peptidiques photosensibles Thèse. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Doctorat en biologie, 113 p.

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Résumé

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L'endothéline (ET) est identifiée comme l'un des plus puissants agents vasoconstricteurs connus chez les mammifères. Ce peptide de vingt-et-un acides aminés agit par l'intermédiaire de deux types de récepteurs couplés aux protéines G, soit ETA et ETe. Il participe à la régulation des fonctions d'une multitude d'organes, entre autres par l'induction de la constriction des vaisseaux sanguins et des muscles lisses et par la production d'hormones. Étant donné ses nombreuses actions physiologiques, l'ET est impliquée dans diverses pathophysiologies dont l'hypertension, l'infarctus du myocarde et l'asthme. Pour établir des thérapies mieux ciblées, il est donc important de comprendre l'interaction entre l'ET et ses récepteurs. Afin d'en connaître davantage sur les sites de liaison des récepteurs de l'ET, nous avons opté pour l'utilisation d'analogues photosensibles de ce peptide dans des essais de marquage par photoaffinité. Pour ce faire, nous avons divisé cette étude en deux volets, soit la synthèse et la caractérisation de nouvelles sondes photosensibles dérivées d'analogues de l'ET et finalement le photomarquage des récepteurs ETA et ETe. Pour débuter, deux peptides possédant une sélectivité pour l'un ou l'autre des récepteurs de l'ET ont été identifiés comme sondes photosensibles potentielles soit l'antagoniste peptidique TTA-386 (hexaméthylèneiminocarbonyle-Leu-trp-ala-j3Ala-Tyr-phe) (Kitada, et al., J. Cardiov. Pharmacol., vol. 22, S128, 1993) qui est sélectif pour le récepteur ETA et l'agoniste IRL-1620 (N-succinyl-[Giu 9, Ala 11 15 ] ET-1 (8-21)) (Takai et al., Biochem.Biophys. Res. Comm., vol. 184, p.953-959, 1992) sélectif pour ETe. Lors de la synthèse chimique de ces peptides, leur séquence en acides aminés a été modifiée par l'ajout du p­ benzoyl-phénylalanine (pBpa), un acide aminé photosensible à l'origine du marquage des récepteurs. La phénylalanine en position 6 du TTA-386 a ainsi été substituée par le D- ou le L-pBpa. Quant au récepteur ETe, c'est la sonde [Bpa5]IRL-1620 qui a été produite par le remplacement de la valine. Pour vérifier l'importance des modifications structurales apportées par le Bpa sur 1'activité et la sélectivité de chacun des peptides photosensibles, l'activité biologique des peptides synthétisés a ensuite été vérifiée sur deux préparations tissulaires exprimant majoritairement soit le récepteur ETA (aorte thoracique de rat) ou le récepteur ETe (parenchyme pulmonaire de cobaye). Des tests de liaison ont aussi été réalisés sur des cellules CHO-Kl transfectées avec le récepteur hETe ou hETA afin de caractériser leur force de liaison avec les récepteurs. Il a alors été démontré que les ligands photosensibles possèdent les caractéristiques pharmacologiques et biochimiques requises pour le photomarquage des récepteurs ETA et ET 8, soit une bonne affinité et une sélectivité pour leur récepteur respectif. Ces outils pharmacologiques ont donc été utilisés pour photomarquer les récepteurs de l'ET. L'irradiation des sondes photosensibles [ 1251-Tyr5, D-pBpa6 ]-TTA-386 et [1251- Tyr5L-pBpa6 ]-TTA-386 en présence de ETA ou de [Bpa5,1251-Tyr6]1RL-1620 en présence de ETs a permis la formation de complexes ligand-récepteur. Puisque le photomarquage de ces récepteurs est impossible en présence d'ET, alors ces résultats nous suggèrent que les sondes photosensibles sont non seulement capables de photomarquer les récepteurs de l'ET, mais elles partagent aussi le même site de liaison que l'ET sur ses récepteurs. Pour mieux définir ces domaines de liaison, les récepteurs photomarqués ont finalement été digérés par deux enzymes différentes soit l'Endoprotéinase Lys-C et la V8 et par un traitement chimique au bromure de cyanogène. Ces clivages ont alors produit des fragments dont au moins un était lié à l'une des sondes photosensibles radiomarquées. Une migration sur gel SDS-PAGE de ces fragments a permis d'identifier la masse des fragments liés aux sondes. L'analyse de ces masses avec la séquence connue de chaque récepteur a alors permis d'identifier l'endroit exact où chaque sonde s'est liée sur les récepteurs de l'ET. En combinant tous les produits de clivage, les résultats suggèrent que [Bpa5,1251-Tyr]6]1RL-1620 se lierait au cinquième domaine transmembranaire du récepteur ETB entre les résidus Trp275 -Leu295 Pour ce qui est du récepteur ETA, ce sont les résidus Trp257-Met278 qui ont été ciblés par les deux sondes photosensibles utilisées. Il est donc intéressant de constater, que le cinquième domaine transmembranaire des récepteurs de l'ET ait été ciblé dans nos deux études de photomarquage. Ce domaine semble donc être d'une importance capitale pour l'interaction des récepteurs ETA et ET8

Type de document: Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Fournier, Alain
Informations complémentaires: Résumé avec symboles
Mots-clés libres: endotheline ; et ; marquage ; peptide ; anaerobie
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 25 sept. 2013 18:04
Dernière modification: 14 déc. 2015 16:30
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/298

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