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New densoviruses, comparison of transcription strategies, recombination and contribution to 3D-structures

Yu, Qian (2015). New densoviruses, comparison of transcription strategies, recombination and contribution to 3D-structures Thèse. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Doctorat en virologie et immunologie, 259 p.

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Résumé

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Les Parvovirus sont de petit virus icosaédriques d’un diamètre d’environ 20-25nm, contenant un génome d’ADN simple brin de 4-6kb et sont classifiés dans la famille Parvoviridae. Les Densoviruses (DNVs) sont des parvovirus infectant les invertébrés, incluant des insectes, les crevettes et les oursins et forme la sous-famille Densovirinae dans la famille des Parvoviridae. La capside des parvoviruses contient 60 protéines structurales dont certaines contiennent une extension N-terminale par rapport aux autres. De plus, la capside de plusieurs parvovirus des vertébrés et DNVs possède une activité enzymatique de phospholipase A2 (PLA2) qui permet l’évasion de la voie endosomale lors de l’entrée du virus dans la cellule, via des bris de la membrane endosomale. Lors des dernières décennies, plusieurs nouveaux parvovirus de vertébrés et invertébrés ont été découverts. Cependant les connaissances concernant leur biologie moléculaire demeurent limitées. Cette thèse contient trois projets différents. Le premier objectif, qui était le projet majeur de cette thèse a débuté par la découverte de trois nouveaux Iteradensoviruses. Depuis 2010, nous avons reçu des échantillons de larves de papillons du céleri (black swallowtail butterfly, Papilio polyxenes) d’une ferme de Granby ainsi que des pupes de papillons monarques provenant de l’Université Cornell et Granby (Québec). Nous avions aussi en notre possession des échantillons de larves de Sibine fusca. À partir de ces échantillons, nous avons isolé et identifié trois nouveaux virus. La méthode utilisée pour leur identification est nommée DNase&RNase-SISPA. Le clonage et le séquençage des génomes de ces trois virus ont révélé une forte identité avec les membres du genre Iteradensovirus de la sous famille Densovirinae. Ces nouveaux Iteradensovirus ont été nommés Papilio polyxenes iteradensovirus (PpDV), Sibine fusca iteradensovirus (SfDV) et Danaus plexippus plexippus iteradensovirus (DppIDV). Avec deux autres Iteradensovirus qui ont été clonés précédemment dans notre laboratoire : Casphalia extranea iteradensovirus (CeDV) and Bombyx mori iteradensovirus (BmDV), la stratégie de transcription de ces 5 iteradensovirus est déterminée dans le second projet. Nous avons montré que ces virus sont tous monosens et contiennent deux grands cadres de lectures (ORF). Le premier permet l’expression de deux protéines non structurales (NS1 et NS2) qui sont générées par des transcrits indépendants, initiés à partir de séquences ATG à seulement 10-15 nucléotides de distance. L’expression des protéines NS est contrôlée par des promoteurs chevauchants. Les deux transcrits NS utilisent le même signal de polyadénylation (poly(A)), situé en aval du motif TATA-box des gènes des protéines structurales (VPs). Les protéines VPs sont toutes générées à partir d’un seul transcrit, par un mécanisme de « leaky scanning » (traduction par balayage fuite des codons d'initiation). Le troisième projet contient différents études sur les densovirus de criquets, incluant un travail de contribution sur la stratégie de transcription d’AdDNV et la découverte de deux nouveaux densoviruses de criquets. AdDNV appartient au genre Amibendensovirus et sa stratégie de transcription des protéines NS est identique aux autres membres de ce genre. Cependant, la stratégie de transcription des protéines VPs est unique. Les protéines structurales sont générées à partir de deux cadres de lecture fendues et emploie une stratégie d’épissage alternatif unique. Cette stratégie est non seulement unique au sein des densovirus mais des parvoviruses de vertébrés aussi. Le premier nouvel densovirus de criquet rapporté de ce projet était Acheta domesticus Mini Ambidensovirus AdMADV. Le nouvel AdMADV possède un petit génome de 4945 nucléotides ainsi que des séquences terminales inversées (ITR) de 199 nucléotides, repliées en forme de Y aux deux extrémités. L’organisation génomique est similaire par rapport aux autres ambidensovirus classiques. Un autre nouvel densovirus de criquet contient une séquence nucléotidique spéciale, où les deux séquences ont codé les protéines de NS et VP séparément. La nouvelle séquence de densovirus AdSDV de Acheta domesticus qui est le premier parvovirus en deux parties, a été rapportée d’émerger de moustiques et par la recombinaison avec AdDNV obtenu d’une activité de la phospholipase A2 qui était capable de infecter les criquets. En plus, une hypothèse de l’origine de ce nouvel virus est aussi présentée ici. Sauf les chapitres principaux de ces trois projets, on a aussi conclu des travails de collaboration comme les projets secondaires dans l’annexe. Le premier projet inclus dans l’annexe I consistait à la détermination de la structure du densovirus AdDNV et d’un parvovirus isolés à partir de serpents (Serpine adeno-associated virus (sAAV)). Pour AdDNV, la structure de la particule mature a été déterminée par cristallographie à rayons X avec une résolution de 3.5-Å. Nous avons aussi montré que l’augmentation de la température des particules menait à l’éjection des génomes. Une structure du virion vide de résolution de 5.5 Å a été obtenue par microscopie cryo-électronique et est identique à la structure de la capside pleine, excepté pour les trois nucléotides ordonnés présent dans la structure de la capside pleine. sAAV est le seul parvovirus de reptile connu (bien que ces dernières années nous avons obtenu la séquence complète d’une seconde reptile AAV à partir de lézards dragons (Pogona), non publié). Nous avons déterminé sa structure à une résolution de 6.7-Å. En comparant cette structure avec les autres AAVs connus, certaines différences significatives ont été observées. Elles sont dues à un changement de conformation dans les régions variables VR-IV, VR-VIII et VR-IX. La comparaison des structures a montré que l’évolution des parvovirus des vertébrés et invertébrés a été effectuée indépendamment, malgré le fait que certaines caractéristiques structurales soient partagées chez tous les parvovirus. L’annexe II a contenu la séquence nucléotidique de trois nouveaux virus à ADN simple brin. Ces virus incluent Helicoverpa armigera Densovirus (HaDNV); Pseudoplusia includens Densovirus (PiDNV); et un nouveau virus à génome circulaire (Circo-Like) isolée à partir de crevettes Penaeus monodon (PmCV-1). .PmCV-1, isolées à partir de crevettes infectées par le virus PstDNV est le premier virus avec un génome d’ADN simple brin circulaire identifié chez les crevettes

Abstract

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Parvoviruses are small, isometric viruses, with a diameter of 20–25 nm, containing a linear, single-stranded DNA genome of 4–6 kb, and have been classified in the family Parvoviridae. Densoviruses (DNVs) are parvoviruses of invertebrates, infecting at least insects, shrimp, and urchins, and form a separate subfamily (Densovirinae) within the Parvoviridae family. The nonenveloped icosahedral capsids consist of 60 structural proteins some of which have N-terminal extensions. Moreover, capsids of many vertebrate parvoviruses and DNVs have a phospholipase A2 (PLA2) activity that allows them to breach the endosomal membrane barrier during cell entry. During the past few decades, many new vertebrate parvoviruses and invertebrate densoviruses have been discovered. However, research on their molecular biology characteristics is still limited. This thesis contains three different projects. The first objective, which is also the major project of this thesis, started with the discovery of three new iteradensoviruses. Since 2010, we got some infected Papilio polyxenes (black swallowtail butterfly) larvae and some infected monarch butterfly pupae from a lab of Cornell University and a farm in Granby (Quebec), respectively. Together with an older, stored Sibine fusca larvae sample, we identified three new viruses. The method we used for identification was named DNase&RNase-SISPA. Cloning and sequencing of the genomes of those three viruses revealed high identities with members of Iteradensovirus genus of Densovirinae subfamily. These new iteradensoviruses have later been named as Papilio polyxenes iteradensovirus (PpDV), Sibine fusca iteradensovirus (SfDV) and Danaus plexippus plexippus iteradensovirus (DppIDV). Together with the other two iteradensovirus Casphalia extranea iteradensovirus (CeDV) and Bombyx mori iteradensovirus (BmDV) which have been cloned and reported from our lab, in the second project we determined the transcription strategies of these five iteradensoviruses. We showed that all these monosense iteradensoviruses genomes contain two large reading frames (ORFs) coding for two non-structural (NS) proteins. NS1 and NS2 that are generated from individual transcripts, which initiated from either side of NS1 ATG with only 10-15 nt distance between each other. The expression of the two NS proteins is controlled by two overlapping promoters. The two NS transcripts shared the same poly(A) motif downstream of the TATA-box of VP. All the structural proteins were generated from a single VP transcript by leaky scanning. The third project contained different studies on cricket densoviruses, which included a contribution work on the transcription strategy of AdDNV and the discovery of two novel cricket densoviruses. AdDNV belongs to the Ambidensovirus genus and its expression strategy of NS proteins is identical with the classical ambidensoviruses. However, the structural proteins (VPs) were generated from two split ORFs and employed a unique alternative splicing mechanism for expression. So far, this expression strategy is not only unique among the other densoviruses, but also among the vertebrate parvoviruses. The first novel cricket densovirus reported in this project was Acheta domesticus Mini Ambidensovirus AdMADV. The novel AdMADV has a small ambisense genome of 4945 nts and the related 199 nt inverted terminal repeats (ITRs) fold into Y-shaped hairpin structure at both telomers. However, its genome organization is identical to classical ambidensoviruses. Another novel cricket densovirus consisted of a special segmented genome, the segments of which coded separately for the NS and VP proteins.. This new Acheta domesticus segmented densovirus, AdSDV, as the first bipartite parvovirus has been reported, arose from mosquitoes and through recombination with AdDNV to obtained phospholipase A2 activity that enabled it to infect crickets. Here, we also provided a hypothesis on the origin of this new virus. Besides the main chapters for the three projects, the thesis also includes some published side projects in the appendix. The first project included in the appendix I aimed to determine the capsid structure for AdDNV and an adeno-associated virus isolated from snakes (serpine adeno-associated virus, sAAV). For AdDNV, the 3.5-Å resolution X-ray crystal structure of the mature virus particle has been determined. It was shown that raising the temperature of the AdDNV particles caused a loss of the ssDNA genome. A 5.5-Å resolution structure of the empty virion was obtained by cryoelectron microscopy and was found to be the same as that for the full, mature virus except for the absence of the three ordered nucleotides. So far, serpine AAV (sAAV) is the only known parvovirus to infect reptiles (although recently, we got the complete sequence of a second reptile AAV from bearded dragon lizards (Pogona), unpublished). In this study, we determined the capsid structure at 6.7-Å resolution. Compared to reported structures of different serotypes of AAVs, significant differences were caused by the conformational changes within the variable regions VR-IV, VR-VIII, and VR-IX. Structural comparisons show that vertebrate and invertebrate parvoviruses have evolved independently, although there are common structural features among all parvovirus capsid proteins. Appendix II contains publications concerning the genome sequences of three novel single-stranded DNA (ssDNA) viruses. These viruses include the Helicoverpa armigera Densovirus HaDNV, Pseudoplusia includens Densovirus PiDNV, and a novel Circo-Like virus isolated from Penaeus monodon shrimp (PmCV-1). PmCV-1 was isolated from PstDNV-infected shrimps, Penaeus monodon, and was the first circular ssDNA virus that has been identified in shrimp.

Type de document: Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Tijssen, Peter
Mots-clés libres: itera-densovirus ; densovirus ; papillon ; criquet ; crevette ; limace ; parvovirus; invertebre ; serpent
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 05 nov. 2015 20:04
Dernière modification: 05 nov. 2015 20:04
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/2761

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