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Rôle de la partie C-terminale de la protéine UL24 du virus de l'herpès simplex 1 dans le trafic intracellulaire

Gonzalez Suarez, Carmen Elena (2014). Rôle de la partie C-terminale de la protéine UL24 du virus de l'herpès simplex 1 dans le trafic intracellulaire Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en virologie et immunologie, 90 p.

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Résumé

Le gène viral UL24 du virus de l'herpès simplex 1 (VHS-1) est conservé parmi tous les virus de la famille des Herpesviridae. La protéine UL24 contient une partie N-terminale qui est hautement conservée parmi les orthologues de cette protéine dans divers virus herpès. Plusieurs études ont démontré l'importance d'acides aminés hautement conservés dans la partie N-terminale d'UL24 dans les modifications nucléolaires induites par le VHS-1 et dans la pathogenèse dans un modèle murin d'infection oculaire. En revanche, la partie C-terminale d'UL24 est pauvrement conservée, et son rôle durant l'infection n'est pas encore déterminé. Des résultats antérieurs ont démontré que lorsqu'exprimée seule, la partie C-terminale d'UL24 se retrouve au Golgi en contexte de transfection transitoire. Notre hypothèse est qu'il y a des résidus dans la partie C-terminale d'UL24 qui sont importants pour la localisation et les fonctions de la protéine dans le cytoplasme. Une série de vecteurs d'expression mammifère encodant UL24 du VHS-1 avec des délétions dans la partie C-terminale ont été produits. De manière intéressante, il a été observé que plusieurs formes délétées d'UL24 se localisent majoritairement dans le noyau en contexte de transfection transitoire de cellules COS-7. En analysant la séquence primaire de la partie C-terminale de la protéine UL24, il a été trouvé que le résidu T195 correspond à un site putatif de phosphorylation et la région comprise entre les acides aminés 250 et 258 correspond à un possible signal d'export nucléaire (NES). La mutagenèse dirigée ciblant des résidus prédits à faire partie d'un NES (L253, F254, V256, V258) a significativement augmenté la localisation nucléaire d'UL24 dans les cellules COS-7 transfectées, suggérant que cette protéine peut faire la navette entre le noyau et le cytoplasme dû à la présence d'un NES identifié dans la partie C-terminale de la protéine; cependant, l'export nucléaire d'UL24 n'a pas eu d'impact sur la distribution de la nucléoline. Pour déterminer l'importance de l'export nucléaire de la protéine UL24 pendant l'infection, des virus recombinants contenant des mutations ponctuelles dans UL24 du VHS-1 ont été produits en utilisant le système « Bacterial Artificial Chromosome » (BAC). Il a été observé que dans les cellules infectées par le virus possédant des mutations dans le NES, la protéine UL24 est seulement détectée dans le noyau. Quoique la leptomycine B (LMB), un inhibiteur de l'export nucléaire dépendant de CRM-1 (exportine 1), bloque l'export nucléaire d'UL24 en contexte de transfection, le traitement des cellules infectées avec la LMB n'a pas eu d'effet sur la localisation d'UL24. Cela suggère que l'export nucléaire d'UL24 du VHS-1 se fait de façon indépendante de cette exportine ou il peut avoir de la redondance avec d'autres voies d'export. Par ailleurs, il a été observé que le virus possédant des mutations dans le NES d'UL24 a produit de gros syncytia comparables à ceux d'un virus déficient en UL24. Cependant, il n'a pas été observé de différences dans sa réplication virale en comparaison au virus de type sauvage. Ces résultats ont mis en évidence la présence d'un NES dans la partie C-terminale de la protéine UL24 du VHS-1 et cette propriété nouvellement découverte pourrait jouer un rôle dans le contexte d'infection virale particulièrement dans les étapes tardives de la morphogenèse virale dans le cytoplasme.

Abstract

The UL24 gene of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is conserved among all Herpesviridae members. The UL24 protein contains an N-terminal portion that is highly conserved between the orthologs of this protein in other Herpesviridae. Previous studies showed the importance of several conserved amino acids in the N-terminus of UL24 for nucleolar modifications induced by HSV-1 as well as for pathogenesis in a mouse model of ocular infection. In contrast, the C-terminal domain of UL24 is poorly conserved and when expressed alone accumulates in the Golgi apparatus; however, its role during HSV-1 infection is unknown. Herein, we tested the hypothesis that there are residues in the C-terminal domain of UL24 that are important for the localisation and the functions of the protein in the cytoplasm. A series of mammalian expression vectors encoding UL24 of HSV-1 with nested deletions in the C-terminal domain were generated. Interestingly, in transient transfection experiments a pronounced nuclear staining was observed in COS-7 cells for several UL24 deleted forms. Examination of the primary sequence of the C-terminus portion of UL24 revealed that the amino acid T195 corresponds to a putative site of phosphorylation and the region between the amino acids 250 and 258 corresponds to a possible nuclear export signal (NES). Site directed mutagenesis targeting residues predicted to make up an NES (L253, F254, V256, V258) significantly enhanced nuclear localisation of the full length protein in transfected COS-7 cells suggesting that this protein is able to shuttle between the nucleus and the cytoplasm due to the presence of the NES; however, blocking the nuclear export of UL24 had no impact on the distribution of nucleolin. To determine the importance of this function during infection, recombinant viruses were generated by introduction of point mutations into the HSV-1 genome cloned as a Bacterial Artificial Chromosome (BAC). It was observed that infection with a virus that encodes UL24 harboring substitutions in the NES led to accumulation of UL24 in the nucleus. Leptomycin B (LMB), an inhibitor of CRM-1-dependent nuclear export blocked nuclear export of UL24 in transfected cells; however, in infected cells, LMB did not have an effect on the localisation of UL24 protein. This result suggests that either UL24 nuclear export is independent of CRM-1 or that there is redundancy with other export pathways. A virus that encodes a UL24 protein with mutations on the NES resulted in a syncytial phenotype similar to that observed for a virus that lacks UL24 (UL24X). Nevertheless, unlike UL24X, replication of this virus was not distinguishable from that of the corresponding wild type strain. In summary, we discovered a NES in the C-terminal portion ofthe HSV-1 UL24 protein. This newly discovered property may play a role in the context viral infection, particularly in the latter stages of viral morphogenesis in the cytoplasm.

Type de document: Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Pearson, Angela
Mots-clés libres: VHS-1 ; transfection
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 05 nov. 2015 21:28
Dernière modification: 05 nov. 2015 21:28
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/2745

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