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La production de protéines unicellulaires, caractérisation et récupération des protéines de lactosérum du lactosérum fermenté.

Yadav, Jay Shankar Singh (2014). La production de protéines unicellulaires, caractérisation et récupération des protéines de lactosérum du lactosérum fermenté. Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en sciences de l'eau, 421 p.

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Résumé

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Le lactosérum est un coproduit de la fabrication du fromage qui contient environ 55% des nutriments résiduels du lait. La présence de ces nutriments mène à une demande chimique en oxygène élevée (DCO), allant de 60 à 80 g/L, ce qui restreint le rejet direct du lactosérum dans les cours d’eau. D’un autre côté, la présence des nutriments comme le lactose, les protéines, les lipides et minéraux font du lactosérum une ressource pour la transformation et la production d’une grande variété de produits à valeurs ajoutées. Ces produits sont la poudre de lactosérum, les protéines de lactosérum, le bioéthanol, les biopolymères, les enzymes, le méthane, les protéines unicellulaires (PU) et les probiotiques. Parmi ces produits à valeurs ajoutées, la transformation du lactosérum et de son perméat en produits protéinés comme les PU est attrayante et de grande valeur puisqu’elle demande un simple procédé de biotransformation en réduisant simultanément la charge polluante. Cependant, la tendance pour la production de PU est d’utiliser uniquement le perméat. La séparation des protéines du lactosérum s’effectue par précipitation ou par filtration membranaire. La présence du lactose dans le lactosérum est un obstacle dans les deux procédés de séparation. Par ailleurs, le coût de récupération élevé et les faibles volumes disponibles font en sorte qu’il est difficile pour certaines industries d’appliquer les deux procédés séparément (c.a.d. la séparation des protéines de lactosérum et le traitement du perméat). Pour ces raisons, la biotransformation du lactosérum non-traité en biomasse pourrait être un meilleur choix pour l’utilisation du lactosérum que la biotransformation du perméat. Par la suite, les protéines résiduelles du lactosérum fermenté pourraient être récupérées facilement par précipitation ou par filtration membranaire. Les protéines récupérées pourraient être mélangées avec de la biomasse ou utilisées séparément. Donc, le but de cette étude était la production de PU de grade alimentaire, la caractérisation des protéines résiduelles et leur récupération en maintenant un équilibre entre le rendement et l’efficacité de l’enlèvement de la DCO. La fermentation du lactosérum par Kluyveromyces marxianus s’est déroulée à 40 °C et pH 3,5 afin d’examiner simultanément la production de PU et l’enlèvement de la DCO, ainsi que pour déterminer les caractéristiques et le sort de la fraction des protéines solubles du lactosérum de même que caractériser les métabolites intermédiaires. Lors de la fermentation de type « batch », le rendement de biomasse obtenu (Yx/s) était de 0,12 g de biomasse/g de lactose avec une réduction de la DCO de 55% (protéines incluses), tandis que la concentration de protéines solubles du lactosérum a diminué de 5,6 à 4,1 g/L. L’électrophorèse a révélé que les protéines fermentées étaient différentes des protéines présentes au départ. Une analyse chromatographique a démontré un changement dans la composition des composés organiques après fermentation. Une fermentation continue avec un système de recyclage de cellules a résulté en un rendement de 0,19 g de biomasse/g lactose et une productivité de 0,26 g/L/h. L’efficacité de l’enlèvement de la DCO était de 78-79% avec une concentration de protéines résiduelles de 3,8-4,2 g/L. Les levures ont été séparées du bouillon fermenté de la fermentation continue par centrifugation. Les protéines solubles résiduelles du surnageant de lactosérum fermenté (SLF) ont été précipitées par traitement à la chaleur (100 °C, pH 3,5 et 10 minutes de temps d’incubation) sous agitation. Le résultat de ce traitement a donné une récupération de 68% des protéines solubles résiduelles et un enlèvement simultané de la DCO résiduelle de 62%. Plus tard, le procédé en deux étapes de précipitation/coagulation des protéines solubles en combinaison avec le carbométhylcellulose (CMC) (traitement thermique suivi de la précipitation par CMC) a permis d’augmenter à 81% la récupération des protéines du total des protéines solubles du SLF. La fermentation discontinue d’une monoculture (K. marxianus) et d’une culture mixte (K. marxianus et C. krusei) à des conditions extrêmes (40 °C et pH 3,5) a démontré de meilleurs résultats pour la culture mixte. En effet, une efficacité d’enlèvement de la DCO de 9% supérieure a été obtenue avec un rendement de biomasse supérieur de 19% et une productivité augmentée de 33%. L’enlèvement maximal de la DCO, 80%, (incluant les protéines résiduelles) a été obtenu à 24 heures de temps de rétention hydraulique (TRH) avec une productivité en biomasse de 0,17 g/L/h. Cependant, la productivité maximale de biomasse, soit 0,38 g/L/h et un enlèvement de 34% de la DCO ont été obtenus pour un TRH de 6 heures. Lors de la comparaison des cultures, le contenu en lysine de la biomasse de la culture mixte était plus élevé que celui de la biomasse de la monoculture. Les cellules de levure K. marxianus ont été perméabilisées avec un détergent anionique, non toxique et biodégradable, le N-lauroyl sarcosine (N-LS), pour déterminer l’activité enzymatique intracellulaire de la β-galactosidase. Les paramètres du procédé de perméabilisation (la concentration de N-LS, le volume de solvant, la température et le temps d’incubation) ont été optimisés. L’activité enzymatique maximale de la β-galactosidase, 1220 IU/g de biomasse sèche, a été obtenue sous des conditions optimales. Les cellules perméabilisées ont par la suite été évaluées pour leur capacité à hydrolyser le lactose du lactosérum. Le meilleur résultat pour l’hydrolyse du lactose, 91%, a été observe à 600 mg (poids sec de cellules/100 mL) dans une solution de poudre de lactosérum (5% p/v) à pH 6,5 et 30 °C pendant un temps d’incubation de 180 minutes. L’hydrolyse simultanée du lactose du lactosérum pour l’amélioration de la croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae, une levure qui ne consume pas le lactose, a été évaluée avec les cellules perméabilisées de K. marxianus. La levure S. cerevisiae peut croître dans le lactosérum hydrolysé par K. marxianus en culture mixte. La biomasse de levure a été traitée en deux étapes avec une combinaison de produits chimiques (N-LS et NH4OH) pour réduire la teneur en acide nucléique afin d’obtenir des PU de qualité alimentaire. La combinaison de produits chimiques a réduit efficacement le contenu en acide nucléique sous 2% avec un relâchement externe simultané de nucléotides. Finalement, les caractéristiques et la récupération des protéines solubles résiduelles de lactosérum dans leur état natif ont été évaluées. La fraction des protéines de lactosérum fermenté est différente des protéines natives du lactosérum et sont partiellement hydrolysées lors de la fermentation. Les paramètres opérationnels d’ultrafiltration (flux de perméat et pression transmembranaire-PTM) ont été optimisés pour des membranes de 1 et 10 kDa. Un flux de perméat de 413 L/h/m2 et une PTM de 80 kPa donne le meilleur résultat pour la membrane de 10 kDa, alors que pour la membrane de 1 kDa, le meilleur résultat a été obtenu avec un flux de perméat de 2760 L/h/m2 et une PTM de 230 kPa. Les conditions optimisées combinées ont permis, respectivement, un recouvrement de 84% et 92% des protéines résiduelles solubles totales du surnagent de lactosérum fermenté d’une monoculture (K. marxianus) et d’une culture mixte (K. marxianus et S. cerevisiae). Les PU ont été produites sous des conditions opératoires extrêmes à partir de lactosérum non traité suivi d’un recouvrement des protéines résiduelles par précipitation. La biomasse et les protéines solides récupérées pourraient être mélangées et pulvérisées à sec, ce qui pourra augmenter le contenu global en protéine et balancer le profil des acides aminés essentiels des PU. Les PU de la culture mixte (K. marxianus et C. krusei) ont été produites sous conditions non-aseptiques avec une efficacité d’enlèvement de la DCO supérieure, un rendement amélioré et une qualité du produit augmentée. Les deux microorganismes ont démontré une interaction physiologique. Le détergent a été efficace pour perméabiliser les cellules afin de permettre au lactose de pénétrer et de subir l’action des enzymes intracellulaires. Les cellules perméabilisées ont efficacement hydrolysé le lactose du lactosérum. Les PU de qualité alimentaire ont été obtenues par prétraitement de la biomasse avec une combinaison de produits chimiques. Les protéines résiduelles après la fermentation ont été récupérées par ultrafiltration dans leur état natif. Donc, en se basant sur la présente étude, trois différentes approches pourraient potentiellement être appliquées pour la biotransformation du lactosérum non traité en produits protéinés.

Abstract

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Cheese whey, a byproduct, is produced during manufacturing of cheese and contains around 55% of the milk residual nutrients. The presence of milk nutrients leads to a high chemical oxygen demand (COD) of 60-80 g/L, it restricts direct whey disposal into natural environmental streams. On the other hand, the presence of nutrients such as lactose, protein, lipids and minerals makes cheese whey a potential resource for the processing and production of a wide range of value-added products, such as whey powder, whey protein, bioethanol, biopolymers, enzymes, methane, single-cell protein (SCP) and probiotics. Among these, the transformation of whey and whey permeate into proteinaceus products such as SCP is attractive and demands since it involves a simple biotransformation process and simultaneous pollution load removal. However, the general trend for production of SCP is using whey permeate. The recovery of whey proteins is carried out by precipitation or membrane filtration. The presence of lactose in whey is an hindrance in both separation processes. Moreover, high recovery cost and low volume availability of whey make it hard for some companies to apply two processes separately (i.e. whey protein separation and whey permeate treatment). Therefore, biotransformation of raw cheese whey to biomass could be a better choice for whey utilization. Thereafter, the residual fermented whey proteins could be recovered via precipitation or membrane filtration with ease. The recovered proteins could be either mixed with biomass or used separately. Thus, the aim of the study was the production of feed- and food-grade SCP, the characterization of the residual proteins and their recovery by maintaining a balance between product yield and COD removal efficiency. Cheese whey fermentation with Kluyveromyces marxianus was carried out at 40 oC and pH 3.5 to examine simultaneous SCP production and COD removal, to determine the fate and characteristics of the soluble whey protein and to characterize the intermediate metabolites. During batch fermentation, the biomass yield (Yx/s) obtained was 0.12 g biomass/g lactose with 55% COD reduction (including proteins), whereas soluble whey protein concentration decreased from 5.6 to 4.1 g/L. Electrophoresis revealed that the fermented whey protein characteristic was different from the native whey protein. Chromatographic analysis showed a change in the composition of organic compounds post-fermentation. Continuous fermentation with a cell recycle system resulted in a biomass yield of 0.19 g biomass/g lactose and a productivity of 0.26 g/L/h. The COD removal efficiency was 78-79% with a residual protein concentration of 3.8-4.2 g/L. The yeast biomass was separated from the fermented broth from continuous fermentation by centrifugation. The residual soluble proteins from fermented whey supernatant (FWS) were precipitated by heat treatment (at 100 oC, pH 3.5 and 10 min incubation) under agitation, which resulted in 68% of protein recovery and a simultaneous residual COD removal of 62%. Further, precipitation/coagulation of the soluble proteins in presence of carboxymethylcellulose (CMC) in two-step process (thermal treatment followed by CMC precipitation) enhanced protein recovery from FWS up to 81%. Batch fermentation of mono (K. marxianus) and mixed (K. marxianus and C. krusei) cultures at extreme conditions (temperature 40 oC and pH 3.5) showed that the mixed culture resulted in 9% higher COD removal efficacy, 19% higher biomass yield and 33% increased productivity. Maximal COD removal of 80% (including residual proteins) was obtained at 24 h HRT with a biomass productivity of 0.17 g/L/h; however, maximal biomass productivity of 0.38 g/L/h and 34% COD removal were obtained at 6 h HRT. The mixed culture biomass showed a higher content of lysine compared to monoculture biomass. Yeast K. marxianus cells were permeabilized with the non-toxic, biodegradable, anionic detergent N-lauroyl sarcosine (N-LS) for accessing the intracellular β-galactosidase activity. The permeabilization process parameters (N-LS concentration, solvent volume, temperature and incubation time) were optimized. The maximal β-galactosidase activity of 1220 IU/g dry weight was obtained under the optimized conditions. Further, the permeabilized cells were evaluated for whey lactose hydrolysis. The maximal lactose hydrolysis of 91% was observed with 600 mg (dry cell weight/100 mL) in whey powder (5% w/v) solution with a 180-min incubation, pH 6.5 and 30 °C. Simultaneous whey lactose hydrolysis for increasing the growth of the non-lactose-consuming yeast Saccharomyces cerevisiae was evaluated with permeabilized K. marxianus cells. S. cerevisiae was able to grow in hydrolyzed whey with K. marxianus in a mixed culture mode. The yeast biomass was treated in two steps with a combination of chemicals (N-LS and NH4OH) to reduce the nucleic acid content in order to obtain food-grade SCP. The combination of chemical was effective to reduce the nucleic acid content below 2% with simultaneous release of nucleotides. Finally, the characteristics and the recovery of the residual soluble whey proteins in native state was evaluated. The fermented whey protein fraction was different from the native whey protein fraction and it was partially hydrolyzed during fermentation. The ultrafiltration operational parameters (permeate flux and transmembrane pressure-TMP) were optimized for 1 and 10 kDa membranes. The permeate flux of 413 L/h/m2 and TMP of 80 kPa resulted in highest recovery with the 10 kDa membrane followed by a permeate flux of 2760 L/h/m2 and TMP of 230 kPa for the 1 kDa membrane. The optimized conditions in combination recovered 84% and 92% of the total residual soluble proteins from mono- (K. marxianus) and mixed cultures (K. marxianus and S. cerevisiae) fermented whey supernatants, respectively. SCP was produced under extreme operating conditions from raw cheese whey followed by residual protein recovery through precipitation. The biomass and the recovered proteinaceous solids could be mixed and spray-dried, which will increase the overall protein content and balance the essential amino acids profile of SCP. The mixed culture (K. marxianus and C. krusei) SCP was produced under non-aseptic conditions with higher COD removal efficiency, enhanced yield and improved product quality. The two microorganisms have demonstrated physiological interactions. Permeabilization of yeast cells with a detergent was effective for accessing intracellular enzyme activity. Permeabilized cells were effective in hydrolyzing whey lactose. Food-grade SCP was obtained by pre-treatment of biomass with a combination of chemicals. The residual proteins after fermentation were recovered by ultrafiltration in their native state. Thus, based on the present study, three different approaches could be potentially applied to biotransform raw cheese whey into proteinaceous products.

Type de document: Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Tyagi, Rajeshwar Dayal
Informations complémentaires: Résumé avec symboles
Mots-clés libres: protéine unicellulaire; lactosérum; production; fermentation; récupération; protéines de lactosérum résiduelles; protéines de lactosérum solubles; K. marxianus; Candida krusei; β-galactosidase; biomasse
Centre: Centre Eau Terre Environnement
Date de dépôt: 17 mars 2015 20:23
Dernière modification: 17 mars 2016 18:04
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/2614

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