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Développement et caractérisation d’analogues du Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide à potentiel thérapeutique.

Doan, Ngoc Duc (2012). Développement et caractérisation d’analogues du Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide à potentiel thérapeutique. Thèse. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Doctorat en biologie, 181 p.

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Résumé

Le pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP), un neuropeptide amidé existant sous deux isoformes équipotentes, fut initialement isolé sur la base de son activité hypophysiotrope. Impliqué dans la régulation de nombreux processus physiologiques, ce neuropeptide exerce son action via l'activation de trois récepteurs de la famille BI des récepteurs couplés aux protéines G dénommés PACI, VPACI et VPAC2. Capable de traverser la barrière hémato-encéphalique, le PACAP est principalement connu pour ses effets pro-différenciateurs et anti-apoptotiques sur divers types cellulaires de même que dans plusieurs modèles in vivo. Plus particulièrement, in vitro, ce dernier est capable, via l'activation de PACI, de réduire considérablement la neurodégénérescence induite par certains agents neurotoxiques (H202, glutamate, éthanol, céramides, 1-méthyl-4-phénylpyridinium/MPPl tandis qu'in vivo, il procure un effet neuroprotecteur dans divers modèles pathologiques (ischémie cérébrale, Parkinson, Huntington, Alzheimer). De plus, en agissant sur son récepteur VPACI, le PACAP est également capable de moduler la réponse inflammatoire associée à la plupart des maladies neurodégénératives, en inhibant la production de chimiokines et du NFkB. Des études in vivo chez les souris ont ainsi démontré que le PACAP pouvait agir comme un facteur de survie neuronal en limitant les processus inflammatoires. Pour résumer, de par sa capacité à stopper la cascade apoptotique via l'inhibition de la caspase-3, ainsi que de par son rôle crucial dans la modulation des processus inflammatoires, le PACAP possède un potentiel thérapeutique très significatif en agissant comme agent multifonctionnel dans l'amélioration de manifestations en lien avec des processus neurodégénératifs. L'objectif initial de ce projet de recherche consistait à développer et caractériser des analogues sélectifs pour les récepteurs PACI et VPACI de façon à s'affranchir des effets indésirables causés par l'activation du récepteur VPAC2. Des modifications, nous permettant de moduler la structure secondaire et les interactions ioniques intra- et intermoléculaires, ont ainsi été introduites au niveau du domaine N-terminal du peptide afin de dégager des éléments clés de la reconnaissance et de l'activation de PACl, VPACl et VPAC2. Les analogues ont été ensuite caractérisés par des tests de liaison et de mobilisation calcique sur des lignées cellulaires transfectées respectivement avec les récepteurs PACI, VPACI et VPAC2. Des composés, présentant un profil pharmacologique amélioré, ont ensuite été évalués dans un modèle in vitro de la maladie Parkinson. Des éléments structuraux clés dans la reconnaissance de chaque récepteur ont ainsi été identifiés et deux analogues, présentant une sélectivité dominante pour les récepteurs PACl et VPACI, i.e. [Ala 7 et [Hyp2]PACAP27, ont été testés pour leur capacité à protéger les neurones dopaminergiques SH-SY5Y contre la toxicité du métabolite MPP+. Ces deux composés se sont ainsi montrés capables de bloquer, comme le PACAP, la toxicité induite par la neurotoxine MPP+ sur des cellules SH-SY5Y aussi bien dans des expériences de pré- que de co-traitement. Dans la deuxième partie de ce projet, nous avons évalué la capacité du PACAP et de ses dérivés à traverser la membrane plasmique. En effet, le PACAP possède des caractéristiques physico­ chimiques, i.e. structure secondaire caractérisée par une hélice amphiphile et une forte anisotropie, qui n'est pas s'en rappeler certaines caractéristiques des protéines de transduction des souches virales, et notamment le peptide TAT du virus VIH. De plus, en utilisant des tests de liaison compétitive et de photomarquage, nous avons démontré la présence de récepteurs nucléaires du PACAP au niveau du système nerveux central, du foie, des testicules et du rein. Nous avons ainsi émis l'hypothèse que le PACAP pourrait agir de façon intracrine en traversant la membrane plasmique afin d'atteindre ses cibles intracellulaires. Nous avons donc mesuré la capacité de translocation du PACAP par cytométrie en flux et microscopie confocale sur des préparation cellulaires (CHO-K1, HEK 293 et HeLa) fixées ou vivantes. Nous avons ainsi démontré que le PACAP traverse la membrane plasmique en impliquant la translocation directe, l'endocytose dépendante de la clathrine et la macropinocytose. Nos résultats suggèrent également que le PACAP peut interagir avec des cibles intracellulaires. De plus, une fois à l'intérieur des cellules, le PACAP n'est pas entièrement dégradé par les enzymes intracellulaires et une quantité importante du peptide intact est également en mesure de sortir des cellules. Pour terminer, nous avons constaté que le PACAP est capable de stimuler la libération calcique et l'initiation de la transcription dans des noyaux cellulaires de testicules de rat. L'ensemble de ces observations soulève la possibilité que le PACAP soit en mesure de déclencher un cycle d'action intracrine conduisant à des effets puissants, de longue durée et ce, à de très faibles concentrations. Ces caractéristiques renforcent ainsi le potentiel thérapeutique du PACAP et d'analogues sélectifs. Dans la dernière partie de cette étude, nous avons démontré que le PACAP et ses dérivés peuvent être classés dans la famille restreinte des cell-penetrating peptides (CPP) endogènes. En effet, le PACAP27 et le PACAP38 biotinylés sont tous les deux capables de transporter efficacement la streptavidine (Strep) dans les compartiments intracellulaires. En particulier, l'efficacité du PACAP38 à livrer des « cargaisons », au moins pour la fluorescéine et la Strep, s'est avérée beaucoup plus élevée que celle du TAT, le plus étudié des CPPs à ce jour. Ces résultats laissent ainsi présager de nouvelles applications thérapeutiques pour le PACAP ou ses dérivés comme CPP pour le transport de molécules bioactives. De plus, étant un peptide endogène, le PACAP devrait être très utile dans la conception d'un CPP inoffensif en évitant de nombreux effets indésirables souvent associés avec les CPPs synthétiques ou viraux. Ainsi, le PACAP, en agissant à la fois comme un peptide endogène et un CPP, pourrait offrir une nouvelle stratégie pour la modulation d'événements intracellulaires. Cependant, l'utilisation des isoformes natives du PACAP, comme transporteur peptidique, est entravée par ses activités pléiotropes associées à l'activation de ses différents récepteurs. Nous avons ainsi réussi à développer deux formes inactives du PACAP, i.e. PACAP(ll-38) et [Arg17]PACAP(ll-38), se comportant comme des CPPs. Des études mécanistiques ont démontré que la translocation directe, l'endocytose dépendante des cavéoles ou la macropinocytose étaient impliquées dans l'internalisation de [Arg17 PACAP(11-38). De plus, il semble que ce dernier soit capable de s'échapper des compartiments endosomaux/lysosomaux et de diffuser dans le cytosol. Ce dérivé a aussi été utilisé dans la livraison intracellulaire de diverses « cargaisons » telles qu'une petite molécule (fluorescéine), des peptides (Idl/3-PA7, JNKI-1), une protéine (Strep), et des polynucléotides (ribozyme, DNA). En particulier, son efficacité en tant qu'agent de transfection s'est avérée comparable à celle de la Lipofectamine 2000, tout en étant non toxique pour les cellules. Cette étude a ainsi non seulement mis en évidence un nouvel aspect de l'utilité du PACAP et de ses dérivés pour une application thérapeutique mais a aussi contribué à l'identification de nouveaux membres de la famille des CPPs. Par conséquent, des analogues inactifs du PACAP représenteraient probablement d'excellents vecteurs pour des usages in vitro et in vivo de transport moléculaire. L'ensemble de ces résultats démontre dans un premier temps, le potentiel très significatif du PACAP comme agent thérapeutique multifonctionnel pour stopper la progression de pathologies dégénératives. et dans un deuxième temps l'utilité du PACAP comme canevas pour la mise au point de nouveaux systèmes de transport pour inhiber ou activer des processus intracellulaires spécifiques.

Abstract

The pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP), a 38-amino acid C-tenninally a-amidated peptide, was first isolated from ovine hypothalamic extracts on the basis of its ability to stimulate adenylyl cyclase from rat anterior pituitary cells. This neuropeptide exerts pleiotropic actions via the activation of three different G protein-coupled receptors named PAC1, VPAC1 and VPAC2. Apart from its unique ability to cross the blood-brain barrier, PACAP is currently weil known for its pro-differentiating and anti-apoptotic effects in various in vitro and in vivo models. For example, via the activation of PAC1 receptors, this peptide is able to reduce in vitro the neurodegeneration induced by neurotoxic agents, i.e. H202, glutamate, ethanol, ceramide, MPP+, and provides a neuroprotective effect in various in vivo models (cerebral ischemia, Parkinson's, Huntington's, Alzheimer's). Moreover, PACAP is also able to modulate the inflammatory response, associated with most of the neurodegenerative diseases, by inhibiting both chemokine production and NFkB binding through the specifie activation of VPAC1 receptors. Moreover, in vivo studies suggested that PACAP could participate to the control of the immune system. The initial objective of the research project was to develop selective PAC1NPAC1 agonists that could promote neuronal survival and avoid non-desired effects caused by the activation of the VPAC2 receptors. To do so, chemical and structural modifications were incorporated in the N­ tenninal segment (region 1-7) of the peptide to identify key elements of the recognition and activation process of PACl, VPAC1 and VPAC2. Peptide derivatives were pharmacologically characterized using a radioligand binding assay and an intracellular calcium mobilization assay, using three cell lines transfected with the PACl, VPACl and VPAC2 receptors, respectively. Analogs with an improved pharmacological profile were further evaluated in an in vitro model of Parkinson's disease (PD). Two compounds, [Ala 7 and [Hyp2]PACAP27, with an improved selectivity toward PACl and VPACl, were identified and their propensity to protect dopaminergic neuroblastic cells (SH-SY5Y) against the toxicity of 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) was evaluated. Results showed that, in both pre- and co-treatment experiments, these two compounds were able to protect SH-SY5Y cells with similar efficacy to PACAP. These results open up new perspectives for the development of a promising peptide-based multifunctional drug for the treatment of PD. In the second part of this project, we demonstrated the ability of PACAP and its derivatives to cross the cellular membrane. Indeed, PACAP possesses structural and physico-chemical characteristics, i.e. extended a-helix exhibiting basic residues that are often found in amphiphilic a-helical antimicrobial peptides and cell-penetrating peptides (CPPs). First, using competitive binding assay along with photolabeling experiments, we demonstrated the presence of nuclear receptors for PACAP in the rat brain, liver, testis and kidney. Using calcium and transcription initiation assays on nuclear fractions from rat testis, we found that PACAP is able to stimulate calcium release and to upregulate de novo DNA synthesis. We thus hypothesized that PACAP could act as an intracrine factor by crossing the plasma membrane in order to reach its intracellular targets. We therefore examined the ability of PACAP to translocate within the plasma membrane by using flow cytometry and confocal microscopy on fixed or living cells (CHO-Kl, HEK 293 and HeLa). We succeeded to demonstrate the ability ofPACAP to cross the plasma membrane via a receptor-independent mechanism. In addition, using specifie inhibitors, we found that PACAP enters the intracellular compartment by direct translocation, clathrin­ dependent endocytosis and macropinocytosis. Our results also revealed that PACAP might be available to interact with intracellular targets. In particular, once inside the cells, PACAP is not fully degraded by intracellular enzymes and a significant amount of intact peptide was able to exit the cells. These observations thus raise the possibility that PACAP is able to trigger a cycle of intracrine actions leading to potent and long-lasting effects, even at very low concentrations. In the last part ofthis study, we demonstrated that PACAP could be classified in the small group of endogenous cell-penetrating peptides. As a matter of fact, biotinylated PACAP38 and PACAP27 were both able to effectively deliver streptavidin (Strep) to intracellular compartments. In particular, the efficiency of PACAP38 to deliver cargoes, at least for Strep and fluorescein, is much higher than that of TAT, one of the most studied and most used CPPs. These findings suggest new therapeutic applications for PACAP and its derivatives as peptide vectors for the delivery of various molecules. In addition, as an endogenous peptide, PACAP and its derivatives could be very useful in the design of a safe CPP not showing the side-effects associated with synthetic or virus-derived CPPs, such as immune responses or cellular toxicity. In particular, being a bioactive CPP, PACAP also offers a new strategy for the modulation of intracellular events. However, the use of native PACAP as a peptide vector could be limited by its pleiotropic activities through the activation of its receptors. To overcome this, we then developed two shorter and inactive derivatives of PACAP, i.e. PACAP(ll-38) and [Arg 17]PACAP(ll-38). Uptake mechanism studies demonstrated that direct translocation, caveolae-dependent endocytosis and macropinocytosis were involved in the internalization of [Arg 17]PACAP(11- 38). More importantly, it seemed that this derivative is able to escape from the endosomal/lysosomal compartments. This derivative were then used for the intracellular delivery of various cargoes such as a small molecule (fluorescein), peptides (Idl/3-PA7, JNKI-1), a protein (Strep) and polynucleotides (ribozyme, DNA). Especially, its effectiveness as a transfection agent was comparable to Lipofectamine 2000, while being non-taxie for cells. This study has not only showed a new aspect of the usefulness of PACAP and its derivatives for therapeutic application, but also contributed to the identification of new members of the CPP family. As such, inactive analogues of PACAP could be excellent vectors for drug delivery in vitro and in vivo. Taken together, these results demonstrate the high potential of PACAP as a multifunctional therapeutic agent not only to stop the progression of degenerative diseases but also as a tool for the development of new transport system for inhibiting specifie intracellular processes.

Type de document: Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Fournier, Alain
Mots-clés libres: neuropeptide ; pacap
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 09 nov. 2015 19:42
Dernière modification: 09 nov. 2015 19:42
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/2361

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