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Étude des mutations de résistance des Escherichia coli uropathogènes résistants à l’antibiotique fosfomycine

Charles, Kathleen (2013). Étude des mutations de résistance des Escherichia coli uropathogènes résistants à l’antibiotique fosfomycine Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 114 p.

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Résumé

Les bactéries Escherichia coli uropathogènes (UPEC) causent plus de 80% des infections du tractus urinaire communautaires (ITU) chez les femmes. Les ITU sont une des infections les plus fréquentes dans les pays industrialisés et représentent un problème économique et de santé publique majeure. À ce jour, seuls les antibiotiques sont utilisés de routine afm de traiter les ITU communautaires. La fosfomycine est un antibiotique fréquemment utilisé dans ce but en Europe, depuis plus de 20 ans. Cependant, seulement 1,5 % à 3 % des souches UPEC cliniques portent des mutations de résistance à la fosfomycine, alors qu'elles présentent un taux élevé de mutations spontanées in vitro (10-8 . Dans cette étude, nous avons étudié les mutations survenant dans des gènes connus comme étant des facteurs de résistance à la fosfomycine. Nous voulons comprendre pourquoi il y a très peu de bactéries résistantes isolées en milieu clinique, alors qu'il y en a tant après culture in vitro. Ces mutations de résistance concernent les gènes des transporteurs de sucres phosphates GlpT et UhpT, porte d'entrée de la fosfomycine dans la cellule. Elles concernent aussi les gènes pts/ de la phosphotransférase du phosphoénolpyruvate et cyaA de l'adénylate cyclase. Ces derniers interviennent dans la régulation et la synthèse de I'AMPc, un activateur des transporteurs GlpT et UhpT. Nous avons utilisé les souches uropathogènes CFT073, 536, ECOR72 et la souche de laboratoire E. coli K-12, pour générer des mutants dirigés dans ces gènes cibles, nécessaires à l'étude. Les délétions affectent directement ou indirectement des systèmes d'importations de sucres, alors l'utilisation des sources de carbone par les bactéries nous informe sur les possibles mutations survenues. Nous avons déterminé la fréquence de génération spontanée de mutants résistants à la fosfomycine chez les souches sauvages, et ce, sur différents milieux de culture riches et en urine humaine. L'utilisation de l'urine a permis de mimer une des composantes du tractus urinaire. Par la suite nous avons isolé plusieurs mutants spontanés et selon leur profil phénotypique, par comparaison avec ceux des mutants dirigés, nous avons pu sélectionner les gènes susceptibles d'avoir subi une mutation afin de les séquencer. Les souches sauvages CFT073 et ECOR72 ont été délétées des deux gènes transporteurs de la fosfomycine (!luhpt et llglpt). Nous avons comparé leur capacité d'infection à celle des souches sauvages dans un modèle murin de co-infection ascendante. Les résultats de co-infection ont montré que les gènes des transporteurs testés n'altèrent pas la capacité d'infection des souches utilisées. Les résultats obtenus en urine démontrent l'impact négatif de ce milieu sur la génération spontanée de mutants résistants, le type de mutation pouvant survenir et le niveau de sensibilité des mutants en présence de fosfomycine.

Abstract

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) strains are responsible for more than 80% of community acquired urinary tract infections (UTis) among women. UTis are the most frequent infections in industrialized countries and represent a major economie and public health concern. Fosfomycin has been a frequently used antibiotic for treatment of UTis in Europe for more than 20 years now. However, overall only 1.5 % to 3 % of UPEC clinical isolates demonstrate resistance to fosfomycin, whereas the rate ofspontaneous resistance to mutations in vitro is quite common (10.8 . In this study, we studied the mutation of genes known to increase resistance to fosfomycin. We wanted to understand why there are so few resistant bacteria isolated from clinical cases (in vivo), when compared to the high rate of resistance in vitro. The resistance mutations include inactivation of the genes encoding sugar phosphate transporters (GltP and UhpT), which mediate entry of fosfomycin into the cell. In addition, inactivation of the pts/ gene encoding the phosphoenol pyruvate phosphotransferase enzyme 1and the cyaA gene encoding adenylate cyclase, intervening in cyclic-AMP regulation and synthesis, also increases fosfomycin resistance as these genes positively regulate the GltP and UhpT transporters. We used UPEC strains CFT073, 536, ECOR72 and the E. coli K-12laboratory strain in order to generale specifie deJetions ofthese target genes. The wild-type CFT073 and ECOR72 strains and their isogenic mutants, deleted of the two fosfomycin transporters genes (lluhptllglpt), were used to infect female mice in an ascending co­ infection process. We also established a phenotypic profile corresponding to each of the targeted deletion mutants, by testing their growth in minimal media containing a variety of sole carbon sources and by determining the fosfomycin minimal inhibitory concentration (MIC). We determined the rate of fosfomycin resistance in vitro, in rich medium and human urine. After that, we isolated several spontaneous mutants, and based on their phenotypic profile in comparison with those of genetically defined mutants, we were able to predict the type of spontaneous mutation and confirm certain changes by sequencing. The results of co-infections in mice showed that Joss of transporter genes did not modify the strain's ability to colonize the mouse urinary tract. Further, results following growth in urine showed the negative impact of this environment on the spontaneous generation of fosfomycin resistance, the types of mutations that occurred and the increased resistance ofthese mutants to fosfomycin.

Type de document: Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Dozois, Charles M.
Mots-clés libres: virulence
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 06 nov. 2015 16:39
Dernière modification: 06 nov. 2015 16:39
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/2357

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