Stratégie de production d’anticorps monoclonaux spécifiques de Ly49B, un récepteur particulier des cellules NK murines.

Lévesque, Annie (2002). Stratégie de production d’anticorps monoclonaux spécifiques de Ly49B, un récepteur particulier des cellules NK murines. Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 141 p.

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Résumé

Les cellules NK de souris peuvent exprimer une variété de récepteurs dont la majorité appartiennent à la famille Ly49 qui contient des récepteurs d'activation et des récepteurs d'inhibition. Le récepteur Ly49B, ayant un ITIM (lmmunoreceptor Tyrosine-based lnhibitory Motif) dans sa portion cytoplasmique, il a le potentiel d'être un récepteur d'inhibition. Toutefois, sa fonction n'a toujours pas été démontrée. Au plan structural, il est le récepteur le plus différent des autres membres de la famille Ly49. Exploitant cette particularité, nous avions comme objectif de produire un anticorps monoclonal spécifique de ce récepteur afin de pouvoir l'utiliser pour déterminer son expression sur différentes cellules notamment les cellules NK, LAK et NKT dans différents tissus de différentes souches de souris, pour analyser la modulation de son expression selon l'haplotype H-2 et finalement pour confirmer sa capacité à inhiber la cytotoxicité des cellules NK. Tout d'abord, 9 rats ont été immunisés avec des cellules LAK de souris. Après avoir analysé les sérums immuns, 4 rats ont été choisis pour faire des fusions entre les cellules spléniques et des cellules myélomateuses de souris. Lors de ces 4 fusions, 1550 surnageants d'hybridomes ont été analysés en ELISA pour la présence d'anticorps spécifiques de séquences uniques du récepteur Ly49B insérées dans des phages filamenteux. 57% des hybridomes sécrétaient des lg, mais aucune de celles-ci ne réagissait avec le récepteur Ly49B. Afin de diminuer la compétition antigénique attribuable aux autres protéines de surface des cellules LAK, nous avons tenté de produire le domaine extracellulaire du récepteur Ly49B soluble en utilisant un système d'expression de protéine dans les levures Pichia pastoris. De nombreuses difficultés sont survenues lors des transformations et seulement 90 transformants ont pu être analysés. Malheureusement, aucun de ceux-ci ne sécrétait une forme stable du domaine extracellulaire du récepteur Ly49B. Finalement, nous avons transfecté des cellules humaine Jurkat T J77.6 avec l'ADNe du Ly49b inséré dans le vecteur d'expression eucaryote SRapuro. Cinq rats ont été immunisés avec ces cellules. Après avoir analysé les sérums pour nous assurer que les animaux avaient réagi à l'immunogène, les fusions ont été effectuées. Lors des 4 premières fusions, 341 surnageants d'hybridomes ont été analysés par cytométrie en flux pour la présence d'lg spécifiques du récepteur Ly49B. Toutefois, étant donné que seulement 10% des hybridomes produisaient des lg, il n'est pas surprenant qu'aucun de ceux-ci n'ait reconnu le récepteur Ly49B. La dose administrée au dernier rat a été augmentée. Un hybridome produisant un anticorps se liant sélectivement aux cellules transfectées avec l'ADNe du récepteur Ly49B a ainsi pu être identifié. Toutefois, malgré que nous ayons atteint cet objectif, le temps alloué pour mes études de maîtrise ne m'a pas permis de poursuivre sa caractérisation. En résumé, l'échec des fusions avec les cellules spléniques des animaux immunisés avec des cellules LAK est probablement attribuable au faible niveau d'expression du récepteur Ly49B sur ces cellules. L'immunisation d'animaux avec la portion extracellulaire soluble de la protéine aurait été la meilleure alternative, mais nous ne sommes malheureusement pas parvenus à la produire. Finalement, l'immunisation des rats avec une forte dose de cellules transfectées a porté fruit. Des analyses futures nous permettront de confirmer la spécificité de l'anticorps et d'enfin poursuivre la caractérisation de ce récepteur particulier.

Type de document:	Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse:	Lemieux, Suzanne
Mots-clés libres:	anticorps ; monoclonal ; ly49b ; recepteur ; nk ; cellule ; tueuse-naturelle ; rats
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	16 sept. 2015 14:59
Dernière modification:	14 déc. 2015 20:10
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/2336

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