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Étude des mécanismes de prise en charge des métaux traces trivalents chez les algues unicellulaires.

Crémazy, Anne (2014). Étude des mécanismes de prise en charge des métaux traces trivalents chez les algues unicellulaires. Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en sciences de l'eau, 141 p.

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Résumé

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Le modèle du ligand biotique (MLB) est un modèle conceptuel utilisé pour la prédiction de l’accumulation et de la toxicité des métaux traces chez les organismes aquatiques. Il décrit l’interaction du métal M avec un transporteur à la membrane biologique comme une réaction de complexation de surface à l’équilibre. En respectant un certain nombre de prémisses, le MLB prédit que l’internalisation du métal sera proportionnelle à sa concentration libre en solution [Mz+] (à composition ionique et pH constants). L’applicabilité du MLB aux métaux bivalents (p. ex. le Cd, le Cu et le Zn) a été relativement bien étudiée et a été généralement confirmée. En revanche, des difficultés analytiques ont freiné l’étude de l’applicabilité du MLB aux métaux trivalents, tels que l’Al. Notamment, l’absence de radio-isotope d’Al adapté au radio-traçage constitue un obstacle majeur pour l’étude de sa biodisponibilité chez les organismes aquatiques. Pour contourner cette limitation, nous avons substitué l’Al par le Sc, un analogue chimique de l’Al possédant un radio-isotope approprié pour le radio-traçage (Sc-46). L’objectif général de ces travaux était d’étudier les mécanismes de prise en charge de ce métal trivalent chez le phytoplancton. Plus précisément, nous avons évalué la capacité du MLB à prédire la prise en charge du Sc chez le phytoplancton. Les hypothèses de cette étude étaient que (i) par analogie aux métaux bivalents, le MLB s’applique aux métaux trivalents et donc au Sc; et que (ii) le Sc et l’Al sont suffisamment semblables chimiquement pour que les mécanismes de prise en charge observés chez le Sc puissent être présumés chez l’Al. Dans un premier temps, pour tester l’hypothèse (i), des flux d’internalisation du Sc (Jint) ont été déterminés chez l’algue verte unicellulaire Chlamydomonas reinhardtii avec des expositions à court terme (≤ 1 h). Ces expositions ont été réalisées à différents pH (pH = [4,50 – 7,90]), concentrations en fluorures ([F-] = [0 – 40 μM]) et concentrations en Sc total ([ScT]). Dans ces différents milieux d’exposition, les concentrations en Sc3+ ([Sc3+]) ont été calculées avec des logiciels de calculs thermodynamiques. Ces valeurs de [Sc3+] ont ensuite été mises en relation avec les valeurs de Jint obtenues, avec l’équation du MLB décrivant les flux d’internalisation. Afin d’évaluer la généralité des résultats obtenus, des expositions au Sc à [F-] = 0 et 10 μM (et à pH = 5,00) ont aussi été réalisées avec l’algue verte unicellulaire Pseudokirchneriella subcapitata. Dans un deuxième temps, pour tester l’hypothèse (ii), des flux d’internalisation du Sc ont été déterminés chez C. reinhardtii à des concentrations variables en Al dissous. Ces expériences avaient pour but d’évaluer la compétition de l’Al pour la liaison au transporteur membranaire emprunté par le Sc. Enfin, la distribution subcellulaire de ces deux métaux a été comparée chez C. reinhardtii après une exposition de 72 h ([ScT] ou [AlT] = 4,5 μM, pH = 7 et [F-] = 380 μM). A chaque condition de pH et de [F-] testée, les flux d’internalisation du Sc chez C. reinhardtii suivaient une cinétique de type Michaelis-Menten en fonction de la concentration en Sc (totale ou libre). Ces profils indiquaient que le Sc en solution était en équilibre thermodynamique avec les sites de transport à la surface biologique, une prémisse importante du MLB. Pour une même [ScT], les calculs de spéciation dans les milieux d’exposition prédisaient une diminution de [Sc3+] de 107 fois entre pH 4,50 et 7,90 et de 2000 fois entre 0 et 40 μM de F-. Cependant, ces baisses très importantes de [Sc3+] ne se reflétaient pas dans des baisses conséquentes des valeurs de Jint mesurées chez C. reinhardtii. Ces observations ont été confirmées avec P. subcapitata à [F-] variable. La compétition des protons pour le transporteur du Sc (effet considéré par le MLB) ne permettait pas d’expliquer la tendance des valeurs de Jint mesurées dans l’ensemble de la gamme de pH testée. Plusieurs hypothèses pour expliquer ces déviations aux prédictions du MLB ont été étudiées. L’augmentation du pH d’exposition de 4,50 à 7,90 a été associée à une hausse du potentiel négatif de la paroi cellulaire de C. reinhardtii. Cet effet, qui a pour conséquence d’augmenter la concentration en Sc3+ à la surface cellulaire, était cependant de trop faible amplitude pour expliquer les fortes valeurs de Jint observées à faibles [Sc3+]. Des calculs du flux diffusif maximal de Sc3+ nous ont indiqué que la diffusion de cette espèce vers la membrane biologique était trop faible pour soutenir les valeurs de Jint observées à pH > 5,00 et à [F-] > 1 μM. Cependant, nos données expérimentales suggéraient que l’équilibre entre le métal et les sites de transport était maintenu. Ainsi, la seule hypothèse permettant d’expliquer nos résultats était celle de la participation d’hydroxo- et de fluoro-complexes du Sc au flux transmembranaire de ce métal, via la formation de complexes ternaires aux transporteurs de Sc3+. La participation de ScOH2+, Sc(OH)2 + et ScF2+ permettait notamment de lever la limitation de diffusion sur la prise en charge du Sc chez C. reinhardtii. Les expériences réalisées avec l’Al ont démontré que ce métal n’était pas (principalement) internalisé par le transporteur du Sc chez C. reinhardtii. Nous avons supposé que la différence de taille entre les ions Sc3+ et Al3+ (sous leurs formes déshydratées et hydratées) pouvait expliquer ce résultat. Cette observation n’exclut pas que les mêmes mécanismes de prise en charge soient impliqués pour le Sc et l’Al chez C. reinhardtii. En effet, des études ont déjà évoqué la prise en charge d’hydroxo- et de fluoro-complexes d’Al pour expliquer des résultats déviant des prédictions du MLB. En accord avec l’analogie présumée entre le Sc et l’Al, la distribution subcellulaire de ces deux métaux était très similaire chez C. reinhardtii, avec une préférence marquée pour les organelles puis les granules, et une très faible association avec les protéines cytosoliques. Ces similarités ont démontré le potentiel intéressant du Sc à substituer l’Al dans des études visant à comprendre les mécanismes de toxicité de l’Al. Le principal résultat de cette étude est que le MLB, dans sa formulation actuelle, ne permet pas de décrire les flux d’internalisation du Sc chez deux espèces de phytoplancton. En effet, comme il a déjà été proposé pour l’Al, des hydroxo- et fluoro-complexes du Sc semblent participer à la prise en charge, via la formation de complexes ternaires de surface. Il apparaît donc de plus en plus incertain que notre conception actuelle des interactions entre les métaux et les membranes biologiques soit adéquate pour les métaux trivalents. Il en découle que l’évaluation du risque environnemental posé par un métal trivalent risque d’être erronée si elle se base sur les prédictions du MLB, c'est-à-dire sur la concentration de l’ion métallique libre en solution.

Abstract

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The biotic ligand model (BLM) is a conceptual tool for predicting the accumulation and toxicity of metals in aquatic organisms. It describes the interaction between a metal and a membrane transport site as a surface complexation equilibrium. Provided that all the model’s assumptions are respected, the BLM predicts that metal internalization will be proportional to the free metal ion concentration in solution ([Mz+]) (at constant ionic composition and pH). A relatively large body of experimental work on the bioavailability of divalent metals (e.g. Cd, Cu and Zn) has shown good agreement with BLM predictions. However, numerous analytical difficulties have hindered the conduct of such studies with trivalent metals, such as aluminum. In particular, the absence of an appropriate Al radio-isotope for tracer experiments is a major hurdle for the study of its bioavailability toward aquatic organisms. To overcome this limitation, we substituted Sc for Al, Sc being a chemical analogue with a convenient radio-isotope (Sc-46) for tracer experiments. Our general objective was to study the uptake mechanisms of trivalent metals with phytoplankton. More precisely, we evaluated the ability of the BLM to predict Sc uptake in phytoplankton. Our hypotheses were that (i) by analogy with divalent metals, the BLM can be applied to trivalent metals and thus to Sc; and that (ii) Sc and Al share enough chemical similarities such that the uptake mechanisms observed with Sc could be similar to those involved in the uptake of Al. To test hypothesis (i), Sc internalization fluxes (Jint) in the green unicellular alga Chlamydomonas reinhardtii were determined with short-term exposures (≤ 1 h). These exposures were performed at different pH values (pH = [4.50 – 7.90]), fluoride concentrations ([F-] = [0 – 40 μM]) and total Sc concentrations ([ScT]). In these media, Sc3+ concentrations ([Sc3+]) were calculated with speciation software. These [Sc3+] values were then related to the obtained Jint values using the BLM equation describing internalization fluxes. In order to assess the generality of the results, Sc exposures at 0 and 10 μM F- (and pH 5.00) were performed with an additional unicellular alga, Pseudokirchneriella subcapitata. To test hypothesis (ii), Sc internalization fluxes in C. reinhardtii were determined over a range of dissolved Al concentrations. The purpose of these experiments was to evaluate whether Al significantly binds to the membrane transporter involved in Sc uptake. Furthermore, the subcellular distribution of these two metals was compared in C. reinhardtii after a 72 h exposure ([ScT] or [AlT] = 4.5 μM, pH = 7 and [F-] = 380 μM). For each pH and [F-] tested, Sc internalization fluxes in C. reinhardtii followed Michaelis-Menten kinetics with total or free Sc concentrations. These profiles indicated that Sc in solution was in chemical equilibrium with Sc at the transport sites on the biological surface, which respects one important BLM assumption. For a given [ScT], speciation calculations for the exposure media predicted a decrease of [Sc3+] by a factor 107 from pH 4.50 to 7.90 and by a factor 2000 from 0 to 40 μM F-. However, these important [Sc3+] reductions were not reflected by comparable decreases in the Jint values measured in C. reinhardtii. These observations were confirmed with P. subcapitata over a range of [F-]. Proton competition for binding to Sc transport sites (effect considered in the BLM framework) could not explain the observed trend in Jint values over the entire tested pH range. Multiple hypotheses were examined to explain these deviations from BLM predictions. The increase in exposure pH from 4.50 to 7.90 was associated with an increase of the negative cell wall potential of C. reinhardtii. However, this effect, which has the consequence of raising [Sc3+] in the cell wall, was too weak to explain the high Jint values observed at low [Sc3+]. Moreover, calculations of Sc3+ maximum diffusive flux indicated that the diffusion of this species to the biological membrane was too low to sustain the Jint values measured at pH > 5.00 and at [F-] > 1 μM. However, our experimental data suggested that a chemical equilibrium was reached between the metal and its transport sites. Thus, the only hypothesis that could explain our results was the contribution of hydroxo- and fluoro-complexes to Sc uptake, via the formation of ternary complexes with Sc3+ membrane transport sites. With the contribution of ScOH2+, Sc(OH)2 + and ScF2+, Sc uptake by C. reinhardtii was no longer diffusion limited. Uptake competition experiments showed that Al was not (mainly) taken up by C. reinhardtii via Sc transporters. We hypothesized that the difference in size between Sc3+ and Al3+ hydrated and dehydrated ions could explain this result. This observation does not rule out the possibility of common transport mechanisms for Sc and Al in C. reinhardtii. Indeed, accumulation of Al hydroxo- and fluoro-complexes has already been suggested to explain results deviating from BLM predictions. In agreement with the proposed analogy between Sc and Al, their subcellular distribution in C. reinhardtii was very similar, with the strongest preference for the organelles, then the granules fraction, and with a very low association with cytosolic ligands. These similarities showed the interesting potential of Sc as a surrogate for Al in toxicity mechanism studies. The main conclusion of this study is that the BLM, in its present form, does not provide an adequate modeling framework for Sc internalization fluxes in two phytoplanktonic species. Indeed, as already reported for Al, some Sc hydroxo- and fluoro-complexes seem to participate in the transmembrane flux, via the formation of surface ternary complexes. Thus, it appears more and more doubtful that our present conception of metal interactions with biological membranes is adequate for trivalent metals. It follows that the assessment of the environmental risk posed by these metals is likely to be incorrect if based on BLM predictions, i.e. on the free metal ion concentration.

Type de document: Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Fortin, Claude
Co-directeurs de mémoire/thèse: Campbell, Peter G. C.
Informations complémentaires: Résumé avec symboles
Mots-clés libres: métal trivalent; algues unicellulaires; modèle du ligand biotique; flux d’internalisation; Chlamydomonas reinhardtii; scandium, aluminium; distribution subcellulaire; trivalent metal; unicellular algae; biotic ligand model; internalization flux; subcellular distribution
Centre: Centre Eau Terre Environnement
Date de dépôt: 06 août 2014 20:29
Dernière modification: 12 nov. 2015 20:37
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/2330

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