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Métabolisme di 1,1,1-trichloro-2,2-bis(4-chlorophenyl)éthane (DDT), du dibenzofuranne et du dibenzo-p-dioxine par certaines dioxygénases du biphényle

L'Abbée, José-Bruno (2006). Métabolisme di 1,1,1-trichloro-2,2-bis(4-chlorophenyl)éthane (DDT), du dibenzofuranne et du dibenzo-p-dioxine par certaines dioxygénases du biphényle Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 101 p.

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Résumé

De multiples substances toxiques, tant pour la faune que pour la flore sont présentes dans l'environnement. Parmi celles-ci compte plusieurs analogues du biphényle, dont les biphényles polychlorés (BPC), les dérivés chlorés du dibenzofuranne (DF), la dibenzo-p-dioxine (DD) ainsi que le 1,1,1-trichloro-2,2- bis(4-chlorophényl)éthane (DDT) qui sont des polluants persistants dans l'environnement. Leur persistance est attribuée à l'absence de voies cataboliques microbiennes efficaces pour leur dégradation. Cependant certaines bactéries isolées de l'environnement tels Comamonas testosteroni B-356, Burkholderia xenovorans LB400 et Cupriavidus necator A5 possèdent une voie catabolique du biphényle capable de dégrader partiellement, par co-métabolisme, certains de ces polluants persistants. La voie catabolique du biphényle est initiée par la dioxygénase du biphényle (BPDO) qui introduit deux atomes d'oxygène sur deux carbones adjacents du noyau biphényle. Cette enzyme comporte trois composantes, dont l'oxygénase interagissant directement avec le substrat pour catalyser l'oxygénation, la ferrédoxine et la réductase de la ferrédoxine étant deux composantes qui catalysent le transport d'électrons du NADH à l'oxygénase. Chez les souches B-356 et LB400, les gènes bphA et bphE codent pour les deux sous-unités qui formant l'oxygénase. Les gènes bphF et bphG codent respectivement pour la ferrédoxine et la réductase de la ferrédoxine. Le développement de BPDO douées de capacités cataboliques accrues envers les analogues persistants du biphényle permettra, éventuellement de construire des bactéries recombinantes portant des voies cataboliques plus efficaces pour la dégradation de ces polluants. Plusieurs travaux récents ont permis d'obtenir, par ingénierie génétique, des BPDO plus performantes capables de dégrader un éventail plus grand de congénères de BPC que les BPDO isolées de souches sauvages. C'est le cas en particulier des BPDO variantes 11-9, Ill-17, 111-34, 111-37 et 111-52 qui ont été obtenues par recombinaison in vitro aléatoire (« DNA-Shuffling ») entre les gènes bphA des souches B-356 et LB400. Les objectifs de ce travail étaient 1-) de vérifier le potentiel catabolique des BPDO parentales de LB400 et B-356 envers le OF et le DO 2-) de comparer les propriétés catalytiques des BPDO variantes 11-9, 111-17, 111-34, 111-37 et 111-52 envers le DDT et des BPDO parentales de LB400 et B-356. Dans le cas du DF, nous avons observé qu'une souche recombinante d'Escherichia coli produisant la dioxygénase de LB400 pouvait dégrader le OF à un taux plus élevé (30 nmol en 18 H) comparativement à une souche exprimant la dioxygénase de B-356 (2 nmol en 18 H). Cependant, les deux dioxygénases ont produit le même dihydro-dihydroxy­ dibenzofuranne comme métabolite majeur, et de faibles quantités de 2,2',3- trihydroxybiphényle. Lorsque le DO était utilisé comme substrat, le 2,2',3- trihydroxybiphényle éther était le seul métabolite détecté et il était produit à un taux similaire pour les deux enzymes, indiquant une attaque similaire pour ce composé. Ces résultats montrent que la régiospécificité de ces deux dioxygénases envers le DF et le DO est semblable, même si pour plusieurs analogues du biphényle, les BPDO de B-356 et LB400 ont fréquemment un patron de métabolisme très différent. Ces résultats suggèrent que la coplanarité du OF et du DO influence la régiospécificité de la dioxygénase d'une manière plus importante que leurs congénères de BPC ayant des substituants en position ortho. L'utilisation de OF marqué au deutérium a permis de valider la production de 2,2',3- trihydroxybiphényle par oxygénation angulaire du OF. Dans le cas du DDT, nous avons démontré que la BPDO de B-356 est aussi efficace que la BPDO de Cupriavidus necator AS, une dioxygénase connue pour sa capacité à oxygéner le DDT efficacement. Cependant, contrairement à la BPDO de AS qui ne produit qu'un seul métabolite, celle de B-356 produit un deuxième métabolite dihydrodiol en petite quantité. D'autre part, la BPDO de LB400 catalyse la dioxygénation du DDT très inefficacement. Nous avons comparé les propriétés catalytiques des variants 11-9, 111-17, 111-34, 111-37 et 111-52 envers le DDT étant des hybrides résultants de recombinaisons génétiques entre bphA de LB400 et de B-356. Les résultats démontrent que la régiospécificité ainsi que l'efficacité à catalyser la réaction varient grandement selon le variant utilisé. Le variant 111-37 était le moins efficace. L'efficacité des variants 111-52, 111-17 et 11-9 à oxygéner le DDT était semblable pour ces enzymes, et ces variants produisaient principalement un métabolite qui était identique au métabolite mineur produit par la BPDO de B-356. Enfin, l'efficacité du variant 11-34 était moindre que celle des trois autres variants, mais cet enzyme produisait exclusivement un métabolite qui correspondait au métabolite majeur produit par la BPDO de B-356. Des analyses RMN de ces métabolites purifiés ont permis d'identifier les deux métabolites comme étant deux diastéréoisomères de 1,1,1-trichloro-2,(4-chlorophény1-2,3-dihydroxy-4,6- cyclohexadiène)-2-(4'-chlorophényl)éthane (DDT-2,3-dihydrodiol). Ces résultats montrent que certaines modifications structurales de la BPDO permettent d'altérer, non seulement la régiospécificité, mais la stéréospécificité de l'enzyme envers les analogues du substrat. Nous avons comparé les séquences primaires en acides aminés des BphA des variants avec celles des BphA parentales. Cette comparaison a permis de montrer qu'un segment de 7 acides aminés de l'enzyme, appelé région Ill, influence significativement la capacité de la dioxygénase à catalyser l'oxygénation du DDT efficacement. Cependant, la stéréospécificité envers le DDT est déterminée par un (ou quelques) acides aminés compris entre les résidus 237 et 261 de BphA de LB400 qui sont communs pour le variant 111-34 et les parents B-356 et AS qui produisent principalement le même métabolite du DDT.

Type de document: Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Sylvestre, Michel
Mots-clés libres: ddt ; dibenzofuranne ; dibenzo-p-dioxine ; dioxygenase ; biphenyle
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 30 sept. 2013 14:55
Dernière modification: 08 déc. 2015 15:23
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/228

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