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Étude de la déshalogénase II de desulfitobacterium frappieri PCP-1.

Thibodeau, Jacinthe (2003). Étude de la déshalogénase II de desulfitobacterium frappieri PCP-1. Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 96 p.

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Résumé

Le pentachlorophénol (PCP), un composé toxique et récalcitrant dans l'environnement, est dégradé selon un mécanisme de déshalogénation réductrice effectué par la bactérie anaérobie stricte, Desuljitobacterium .frappieri PCP-1. D. .frappieri est le seul microorganisme connu qui peut déshalogéner le PCP jusqu'au 3- chlorophénol. Deux déshalogénases, sensibles à l'oxygène et d'origine membranaire, seraient impliquées dans ce processus. La déshalogénase I, induite par le PCP et le 2,4,6-trichlorophénol (2,4,6-TCP), effectue la déshalogénation principalement en position ortho de la molécule alors que la déshalogénase II, induite par le 3,5- dichlorophénol (3,5-DCP), effectue la déshalogénation principalement en positions meta et para. Les objectifs de ce projet de maîtrise étaient (I) d'optimiser les conditions de production de la déshalogénase II par la bactérie, (II) de la purifier et (III) de la caractériser. L'étude des conditions de culture de D..frappieri a permis d'obtenir des préparations membranaires dont l'activité de déshalogénation in vitro était 100 fois plus élevée que l'activité initialement obtenue avec la bactérie. En effet, la température d'incubation des cultures s'est révélée un facteur important où l'activité maximale est obtenue à des températures entre 22-30°C comparativement à 37°C qui est la température optimale de croissance. Le pH optimal de croissance est 7,5 et la biomasse est recueillie à la fin de la phase exponentielle de croissance. La déshalogénase II, présente dans les préparations membranaires, a été solubilisée dans un tampon phosphate de potassium (pH 8,0) contenant 0,1% de Triton X-100, 20 % de glycérol et 1 mM de dithiothréitol. Une activité de déshalogénation du 3,5-DCP d'environ 6,17 11moles 3-CP min-1 mg de protéines-1 a été obtenue pour la fraction membranaire solubilisée. La déshalogénase II a été purifiée jusqu'à homogénéité et son poids moléculaire a été évalué à 57 kDa par SDS-PAGE. Une caractérisation partielle de cette enzyme a été entamée. Le pH optimal de l'activité enzymatique se situe à 6,8-7,0. Le sulfite (2,5 mM) inhibe à 100% l'activité de la déshalogénase II alors que le sulfate et le nitrate n'ont aucun effet à des concentrations jusqu'à 75 mM. Les essais d'inhibition par l'iodopropane ont révélé que la déshalogénase Il, autant dans la préparation membranaire solubilisée que dans la préparation semi-purifiée, est inhibée en présence de 1-iodopropane, mais dans les conditions utilisées, l'activité n'est que faiblement restaurée en présence de lumière. Les résultats obtenus suggèrent la présence d'une cobalamine comme cofacteur. Enfin, le spectre d'activité démontre que le PCP, le 3,4,5-trichlorophénol et le 3,5-DCP sont rapidement déshalogénés en positions para et meta. Une activité plus faible de déshalogénation en position ortho est aussi observée pour le 2,4,6-TCP et le 2,4-DCP. Ce travail a permis la purification et la caractérisation partielle d'une nouvelle enzyme de D. .frappieri PCP-1 pouvant déshalogéner différents chlorophénols en positions para et meta.

Type de document: Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Beaudet, Réjean
Mots-clés libres: deshalogenase ; halorespiration
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 12 mai 2014 20:54
Dernière modification: 18 déc. 2015 19:56
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/2264

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