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Exploration de la spécificité de subtrat des glycosides hydrolases du clan GH-A.

Masri, Nabil (2003). Exploration de la spécificité de subtrat des glycosides hydrolases du clan GH-A. Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 145 p.

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Résumé

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Les glycosides hydrolases sont des enzymes hydrolysant les liens glycosidiques contenus entre des unités saccharidiques ou entre une unité saccharidique et un groupement aglycone. La classification de ces enzymes se fait en familles et en clans dans lesquels on retrouve des enzymes ayant une structure tertiaire similaire, un même mécanisme d'hydrolyse, mais une spécificité de substrat qui peut être très variée. Le clan GH-A est le plus diversifié des 12 clans existants. En tout, 32 substrats différents sont hydrolysés par les enzymes de ce clan malgré un repliement commun de type tonneau-(p/a.)8. Afin d'identifier des éléments structuraux gouvernant la spécificité de substrat des enzymes du clan GH-A, la structure tridimensionnelle de la xylanase 1OA de Streptomyces lividans a été superposée par modélisation moléculaire avec les autres structures disponibles de ce clan. De là, 16 positions ont été identifiées comme potentiellement impliquées dans la spécificité de substrat chez les glycosides hydrolases du clan GH-A. Six mutations ont été introduites par PCR dans le gène de la xylanase 1OA et les gènes résultant ont été exprimés chez S. lividans. Après purification, les enzymes mutantes ont été comparées à l'enzyme sauvage au niveau du point isoélectrique apparent, du profil de masse moléculaire, du spectre de dichroïsme circulaire, de la dénaturation thermique, du spectre de fluorométrie ainsi que de l'activité spécifique et du profil d'hydrolyse en présence de divers substrats. En présence de laminarin, un polysaccharide constitué de molécules de glucose unies par des liens p(1 3), la mutation V202F a provoqué une augmentation d'activité spécifique de 1,86 fois relativement à l'enzyme sauvage. De plus, le profil d'hydrolyse a montré qu'en présence de p-glucan et de lichenane, deux polysaccharides composés de molécules de glucose unies par des liens B(1-3) et B(1-4), la protéine mutante V202F libère des oligosaccharides que l'enzyme sauvage ne libère pas. Pour sa part la double mutation R275A/S276W a fait augmenter l'activité spécifique de 1,66 et 2,07 fois en présence respectivement de p-glucan et de lichenane relativement à l'enzyme sauvage tout en ayant le même profil d'hydrolyse.

Type de document: Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Dupont, Claude
Informations complémentaires: Résumé avec symboles
Mots-clés libres: saccharide ; glycoside ; hydrolase ; enzyme
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 13 mai 2014 18:24
Dernière modification: 18 déc. 2015 19:50
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/2175

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