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Étude des systèmes de sécrétion Sec & Tat chez streptomyces lividans

Guimond, Julien (2007). Étude des systèmes de sécrétion Sec & Tat chez streptomyces lividans Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 166 p.

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Résumé

La voie de sécrétion Tat nouvellement étudiée, permet la sécrétion de précurseurs déjà repliés dans le cytoplasme. Les précurseurs Tat se distinguent par la présence d'une séquence consensus de 7 résidus d'acide aminé dans leur peptide signal. En recherchant ce motif consensus, le programme informatique TatScan prédit 129 substrats Tat chez Streptomyces coelicolor. Les sécrétomes de Streptomyces lividans sauvage, une proche parente de S. coe/icolor, et de son mutant du système Tat ont été étudiés pour vérifier la justesse de ces prédictions informatiques. Comme le sécrétome dépend des sources de carbone du milieu de culture, les bactéries ont été cultivées dans quatre milieux liquides avec une source de carbone différente, soit le xylose, le glucose, la chitine et un extrait de terre. Les protéines sécrétées ont été recueillies et séparées par électrophorèse sur gel en deux dimensions. Les protéines sécrétées par la bactérie sauvage mais absentes chez le mutant étaient vraisemblablement Tat et ont été analysées au spectre de masse. Les milieux xylose, glucose, chitine et terre ont permis d'identifier respectivement 13, 14, 27 et 19 protéines candidates à la sécrétion par le système Tat pour un total de 63 protéines différentes. Parmi celles-ci, les produits des gènes SC00677, SC01639, SC02068, SC02780, SC02828, SC06005 et SC06131, prédits par TatScan, sont confirmés pour la sécrétion Tat. Sept autres protéines, codées par les gènes SC01230, SC01860, SC02591, SC05260, SC06109, SC06199 et SC06590, sont probablement Tat-dépendantes, mais possèdent un peptide signal qui échappe à l'analyse de tous les outils de prédictions informatiques. Les protéines codées par les gènes SC00494, SC00638, SC03967, SC05113, SC05420, SC05646, SC05776, SC06963 et SC07501 sont localisées dans la membrane et possèdent toutes un peptide signal ne correspondant pas à un peptide signal Tat. Les trois protéines codées par les gènes SC04622, SC02149 et SC05843 ne présentent aucun peptide signal et sont proposées comme candidates à la sécrétion par un mécanisme non conventionnel. Les 37 autres protéines sont cytoplasmiques, membranaires ou de localisation inconnue et ne comportent pas de peptide signal. Les protéines destinées à la sécrétion sont synthétisées sous la forme d'un précurseur qui possède à son extrémité N-terminale une séquence appelée peptide signal qui est clivé lors de la sécrétion pour libérer la protéine mature. La majorité des précurseurs sont sécrétés par le système Sec, qui requiert que les précurseurs conservent une forme linéaire. Chez les bactéries à gram négatif, la chaperonne dédiée SecB permet à plusieurs précurseurs de conserver leur forme « dépliée » propre à la sécrétion Sec. Chez les bactéries à gram positif, aucun homologue fonctionnel de cette chaperonne n'a été découvert jusqu'ici. En purifiant le précurseur de la xylanase A2 de S. lividans, une protéine Sec-dépendante, nous avons tenté de co-purifier une chaperonne homologue à SecB. Pour ce faire, une étiquette d'histidines a été ajoutée à la xylanase A2, ce qui a permis la purification du précurseur de la xylanase A2 contenu dans la fraction cytoplasmique par chromatographie d'affinité sur colonne de sépharose-nickel. Une quinzaine de protéines accompagnaient le précurseur de la xylanase A2 et après analyse au spectre de masse, aucune ne présentait les caractéristiques d'une chaperonne éventuelle. Nous avons ensuite tenté de lier le précurseur à la chaperonne en utilisant des cross-linkers. La formation de liaisons réticulaires avec le DSP, le DSS et le GMBS suivi d'une chromatographie d'affinité sur colonne de sépharose­ nickel n'a pas permis de récupérer un complexe formé du précurseur de la xylanase A2 et d'une chaperonne. Parallèlement, la fraction membranaire a été testée pour la présence de complexes, mais sans succès. Finalement, nous émettons 1'hypothèse que la xylanase A2 puisse être sécrétée de façon co-traductionnelle, sans l'aide d'une chaperonne. Comme les protéines sécrétées par le système Tat doivent être tout au moins partiellement repliées dans le cytoplasme, nous avons tenté de démontrer la présence d'une chaperonne qui favoriserait le repliement de la xylanase C de S. lividans, une protéine spécifiquement sécrétée par ce système. Comme pour la xylanase A2, la xylanase C a été munie d'une queue d'histidine permettant sa récupération sur colonne de sépharose-nickel. Les cross­ linkers DSP, DSS, GMBS et EDC ont été utilisés pour créer des liaisons réticulaires entre le précurseur de la xylanase C et sa chaperonne et ces complexes ont été purifiés par chromatographie d'affinité sur colonne de sépharose-nickel, sans pouvoir identifier la chaperonne. Une colonne d'immuno-affinité a été préparée pour tenter de récupérer ces complexes mais aucun des complexes récupérés ne contenait de xylanase C. Des complexes formés de la pré-xylanase C et de sa chaperonne ont été cherchés dans la fraction membranaire mais seul le précurseur a été retrouvé. Finalement, des expériences préliminaires de liaison avec le formaldéhyde, qui forme des liens covalents avec les protéines, semblent faire apparaître des complexes dont les composantes n'ont pas été analysées pour le moment.

Type de document: Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Morosoli, Rolf
Mots-clés libres: streptomyces lividans ; secretion ; système ; precurseur ; xylanase
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 26 sept. 2013 13:32
Dernière modification: 08 déc. 2015 15:19
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/216

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