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Développement d’une lignée cellulaire de type COS-7 exprimant une forme soluble d’enzyme de conversion de l’endothéline recombinante (hECE-1sol) et caractérisation enzymatique préliminaire.

Lampron, Philipe (2003). Développement d’une lignée cellulaire de type COS-7 exprimant une forme soluble d’enzyme de conversion de l’endothéline recombinante (hECE-1sol) et caractérisation enzymatique préliminaire. Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en sciences expérimentales de la santé, 103 p.

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Résumé

L'endothéline est un acteur important impliqué dans plusieurs anomalies cardiovasculaires telles l'hypertension artérielle et l'infarctus. Ce peptide composé de 21 acides aminés est identifié comme un des plus puissants vasoconstricteurs connus. Sa production est assurée par une enzyme de conversion, 1 'ECE, présente à la surface des cellules endothéliales. Celle-ci clive le précurseur, la Big-endothéline (BigET) en endothéline et ce, entre les acides aminés valine/isoleucine 22 et tryptophane 21. Notre objectif a été de produire 1'enzyme par génie génétique et ce, à partir des méthodes de clonage moléculaire et de transfection chez les cellules mammifères de type COS-7. Le matériel génétique de départ, le pME18ShECE-1sol a été utilisé dans le cadre d'une transfection transitoire avec différents types cellulaires, soit CHO, HEK 293 et COS-7. Par la suite, étant donné une production trop faible de la protéine, la construction d'un vecteur plasmidique exprimant un gène de résistance permettant un processus de sélection a été réalisée à partir du vecteur précédent. Ce nouveau vecteur, porteur de l'ADNe de la portion extracellulaire de l'enzyme fusionné avec le peptide signal de la phosphatase alcaline (pCI-neohECE-1sol) a pu être transfecté dans les cellules COS-7 permettant ainsi l'expression stable de hECE-1 sous une forme soluble. Les cellules recombinantes ont été subséquemment cultivées et sélectionnées en fonction de leur capacité de synthèse de l'enzyme de conversion retrouvée dans le surnageant. Différents essais de purification ont été tentés, soit une chromatogaphie sur concanavaline A, une chromatographie d'affinité utilisant un anticorps dirigés contre hECE-1sol, une chromatographie d'affinité utilisant le cofacteur Zn et une résine à haute affinité pour l'albumine. Seules la chromatographie d'affinité pour le Zn suivi de l'élimination de l'albumine au moyen de la résine d'affinité spécifique à cette dernière ont démontré un résultat satisfaisant. La technique d'immunobuvardage de type Western a permis de confirmer la production de l'enzyme après visualisation d'une bande aux environs de 120 kDa dans la fraction brute et semi-purifiée, soit le poids moléculaire de la forme monomérique de l'ECE. L'activité de cette enzyme recombinante a été vérifiée avec la fraction non purifée et semi-purifiée. Ainsi, un test ELISA conçu pour le dosage de la production d'ET-1 après réaction de hECE-1sol et de la BigET-1 a permis de fournir différents paramètres caractéristiques. Les résultats partiels ont révélé une concentration enzymatique optimale de 5 )lg/mL pour la fraction brute et de 0,3 )lg/mL pour la fraction semi-purifiée. Le temps d'incubation optimal pour cette caractérisation a été de 4 heures, mais les paramètres de cinétique enzymatique devront être reconsidérés étant donné l'incapacité de saturation du système enzymatique. Ces résultats devront être vérifiés avec une fraction purifiée adéquatement pour permettre une comparaison plus significative avec les données observées dans la littérature. Toutefois, la production de cette forme soluble permet de fournir un outil unique pour l'étude de la spécificité de son clivage avec différents analogues de son substrat. En effet, certains analogues ont été testés dans la présente étude et les résultats semblent suggérés une réaction croisée entre l'analogue et son substrat favorisant une meilleure orientation au site catalytique résultant en un clivage spécifique par hECE-1sol. Différents essais au moyen d'autres analogues de la BigET devront éventuellement être effectués afin de déterminer les résidus-clés du substrat, ainsi que la longueur minimale de la BigET-1 permettant un clivage spécifique par 1'enzyme.

Type de document: Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Fournier, Alain
Mots-clés libres: endotheline ; hypertension ; infarctus ; peptide ; ece ; vasoconstricteur
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 12 mai 2014 20:49
Dernière modification: 18 déc. 2015 19:48
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/2157

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