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Identification et caractérisation du gène p10 et de la protéine P10 du granulovirus de Choristoneura fumiferana (ChfuGV) : Production d’anticorps anti-P10 par immunisation classique et par immunisation génétique.

Jean, Myriam (2003). Identification et caractérisation du gène p10 et de la protéine P10 du granulovirus de Choristoneura fumiferana (ChfuGV) : Production d’anticorps anti-P10 par immunisation classique et par immunisation génétique. Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 152 p.

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Résumé

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La tordeuse des bourgeons de l'épinette, Choristoneura.fum(ferana (Clemens), est un insecte ravageur des forêts de conifères en Amérique du Nord . En période épidémique, cet insecte entraîne d'importantes pertes économiques dans le domaine forestier. Dans le but de diversifier les outils disponibles dans la lutte biologique contre cet insecte, notre laboratoire envisage dans un projet d'envergure l'utilisation, comme biopesticide, d'un baculovirus appelé le granulovirus de Choristoneura.fum(fèrana (ChfuGV). La protéine P 10 est une protéine majeure des baculovirus qui semble jouer un rôle dans la pathogenèse associée à 1 'in rection aux baculovirus. Dans ce projet de recherche, nous avons montré la présence du gène codant pour la protéine P 10 chez le génome du ChfuGV. Le gène p 10 localisé sur le brin antisens du génome viral est juste en aval, mais dans le sens opposé, du gène p74. L'analyse de la séquence nucléotidique ct de la séquence déduite en acides aminés du gène p JO nous a permis de confirmer l'identité de ce dernier. Cette identification a été réalisée grâce à la présence et à la disposition particulière, dans la région N terminale, de résidus amino-acidcs hydrophobes (motif hcpta) qui sont impliqués dans la formation d'une structure fonctionnelle en supcrhélice caractérisant les protéines P 10 des baculovirus. Les études comparatives des séquences en acides aminés des protéines P 10 de diflërents baculovirus suggèrent des homologies fonctionnelles de ce domaine. L'utilisation des systèmes d'expression procaryote (pQE32) nous ont permis de produire la protéine recombinante P 10 dans des cellules bactériennes E. Coli M 15 (Rep4) à des concentrations atteignant 1 ,2 mg/L de culture. La protéine P 10 a été puri fiée par chromatographie d'affinité et utilisée dans les expériences d'immunisation classique de souris Balb/c pour la production des anticorps polyclonaux anti-P lO. La spécificité de ces anticorps a été confirmée par immunobuvardage de type Western en utilisant la protéine recombinante Pl0 comme antigène. L'étude de la cinétique de production des anticorps anti-p1O, à l'aide d'un test ELISA, a montré que les premiers anticorps apparaissent après la première dose de rappel, vers le 20e jour suivant l'immunisation initiale. Cette production d'anticorps a continué d'augmenter jusqu'au jour 50 (après la 3e dose de rappel) avec un titre s'approchant du 106 . L'utilisation du système d'expression eucaryote pcDNA3, exprimant la protéine P 10, pour 1 'immunisation génétique de souris Balb/c avait pour but initial 1 'exploration d'une avenue plus conviviale et moins coûteuse pour la production des anticorps anti-p 1 O. En effet, l'immunisation des souris avec l'ADN nu {plasmide pcDNA3/p 1 0) s'est avérée très efficace avec des titres d'anticorps dépassant les 104 . Ce titre d'anticorps anti-piO obtenu par immunisation génétique est relativement élevé, en particulier si l'on tient compte du fàit, de l'absence assurée de protéines bactériennes contaminantes. Les expériences d'immunisation nous ont également permis d'évaluer le potentiel immuno-adjuvant de 1'IL-2. Contrairement a nos attentes, 1'11-2 a eu un effet inhibiteur ou ralentissant sur la production des anticorps anti-p10 lors de 1 'immunisation classique (protéine plO recombinante) et lors de l'immunisation génétique (plasmide pcDNA 3/p 1 0). Des investigations plus poussées sont nécessaires pour comprendre et expliquer la logique de ces événements. Ce projet de recherche nous a permis de comparer la cinétique de production d'anticorps par immunisation génétique et immunisation classique. La cinétique de production d'anticorps anti-P 10 est plus lente dans le cas de l'immunisation génétique (49e jour). Les premiers anticorps anti-p 10 apparaissent vers le 20e jour suivant l'immunisation initiale classique. La production d'anticorps est plus faible avec l'immunisation génétique, avec des titres d'anticorps de l'ordre de 104 comparés à des titres de l'ordre de 106 avec l'immunisation classique. Il faut cependant noter qu'il y a une production variable d'anticorps (de nulle à très élevée) entre les diftërents individus d'un même groupe d'animaux lors de l'immunisation génétique. Ceci est probablement dû à une transfection inconstante et/ou à un échec du plasmide et des cellules transfectées à diriger la transcription et la production de la protéine recombinante P 1 O. Il serait donc nécessaire de développer des techniques qui vont nous permettre de nous assurer d'une transfection constante et efficace permettant une production de la protéine recombinante par les cellules transfectées.

Type de document: Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Guertin, Claude
Co-directeurs de mémoire/thèse: Merzouki, Abderrazzak
Informations complémentaires: Résumé avec symboles
Mots-clés libres: Anticorps ; granulovirus ; tordeuse ; biopesticide ; baculovirus
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 13 mai 2014 18:27
Dernière modification: 18 déc. 2015 19:47
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/2141

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