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Identification par banque phagique d’un peptide, SP5.2, specifique au recepteur Flt-1 ayant un potentiel anti-angiogenique.

El-Mousawi, Mayada (2003). Identification par banque phagique d’un peptide, SP5.2, specifique au recepteur Flt-1 ayant un potentiel anti-angiogenique. Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 84 p.

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Résumé

Le cancer est une maladie génétique étant donné qu'elle peut être retracée jusqu'à des altérations au niveau de gènes spécifiques sans pour autant, dans la plupart des cas, être d'origine héréditaire. Les altérations génétiques conduisant à la plupart des cancers apparaissent dans l'ADN des cellules somatiques au cours de la vie de l'individu affecté. Suite à ces changements génétiques, les cellules cancéreuses prolifèrent de façon incontrôlée, pouvant produire des tumeurs malignes qui envahissent le tissue environnant. Les cellules des tumeurs malignes peuvent métastaser et se propager dans le corps en entrant dans la circulation lymphatique et vasculaire, et former des tumeurs secondaires. En se développant, la tumeur stimule la formation de nouveaux vaisseaux sanguins; ce processus est appelé angiogenèse. La cellule tumorale stimule l'angiogenèse en sécrétant des facteurs de croissance qui agissent au niveau des cellules endothéliales des vaisseaux sanguins environnants, les stimulant ainsi à proliférer et à développer de nouveaux vaisseaux. Parmi ces facteurs de croissance, le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) est retrouvé dans plusieurs types de tumeurs. Son activité angiogénique a été démontrée in vitro et in vivo, ce qui en fait une cible de choix pour le développement d'une thérapie anti-tumorale. Le VEGF et ses récepteurs sont la cible d'un intérêt important par leur rôle dans la formation des vaisseaux sanguins (angiogenèse et vasculogenèse) dans une variété de processus physiologiques vitaux incluant l'embryogenèse et la guérison des liaisons tissulaires, mais également dans des processus patho-physiologiques, tels que la croissance tumorale, la réthinopatie proliférative et certaines maladies inflammatoires chroniques (Folkman 1995, Ferrara 1996). Parmi les facteurs de croissance, le VEGF joue aussi le rôle exclusif de mitogène spécifique des cellules endothéliales via son action sur la prolifération et le mouvement des cellules endothéliales, le remodelage de la matrice extracellulaire, la formation des tubules capillaires et la perméabilité vasculaire (Wang et al., 2000). L'activité du VEGF est médiée par l'attachement à deux récepteurs de haute affinité pour le VEGF, le Human Kinase Domain Receptor (KDR) et le Fms-like Tyrosine Kinase receptor (Flt-1) (Shibuya et al., 1990), qui sont exprimés sélectivement par les cellules endothéliales au cours de l'embryogenèse et lors des pathologies reliées au VEGF (Millauer et al., 1993). Ces deux récepteurs sont des tyrosine kinases de type III (Vaisman et al., 1990, Kaipainen et al., 1993) qui subissent une dimérisation induite par le ligand, déclenchant ainsi un signal de transduction. Les études chez les souris ont démontré que l'expression de KDR atteint son plus haut niveau au cours de l'angiogenèse et de la vasculogenèse embryonnaires (Millauer et al., 1993). De plus, un faible niveau d'ARNm de Flt-1 est détecté pendant la croissance du fœtus, un niveau moyen au cours de l'organogenèse, et un haut niveau chez la souris nouveau-née (Peters et al., 1993). Il a été démontré qu'un troisième récepteur tyrosine kinase semblable au fins, le Flt-4, et dont l'expression est limitée à la vasculature lymphatique, jouerait un rôle dans l'angiogenèse lymphatique (Dumont et al., 1998). De plus, il se lierait au VEGF-C et au VEGF-D mais pas au VEGF (Achen et al., 1998). Les expériences chez des souris déficientes en Flt-1 ou en KDR ont révélé que le KDR est essentiel dans le développement des cellules endothéliales, alors que Flt-1 serait nécessaire pour 1 'organisation de la vascularisation embryonnaire (Fong et al., 1995; Shalaby et al., 1995). Finalement, le système VEGF-Flt-1 jouerait un rôle important dans la stimulation de l'angiogenèse tumorale, faisant de Flt-1 une cible intéressante dans le développement d'agents anti-angiogéniques (Shibuya 1995). Le récepteur humain Flt-1 est composé de 7 domaines immunoglobulaires extracellulaires contenant la région de liaison du ligand, une petite séquence trans­ membranaire simple, et une région intracellulaire contenant le domaine tyrosine kinase. Les séquences en acides aminés de Flt-1 et KDR possèdent une homologie d'environ 45%. Par contre, Flt-1 possède une plus haute affinité pour VEGF (K0=10-20pM) comparée à KDR (Ko=75-125pM). L'activation du récepteur Flt-1 par VEGF régule l'interaction des cellules endothéliales entre elles ou avec la membrane basale sur laquelle elles résident (Quinn 1993, Waltenberg 1994). L'ARNm du récepteur Flt-1 peut subir un épissage alternatif codant pour le récepteur Flt-1 complet ou pour une forme soluble, Flt-1 s. Flt-1 s retient sa haute affinité de liaison au VEGF et inhibe complètement, par un mécanisme de dominant négatif, la mitogenèse des cellules endothéliales stimulée par le VEGF (He et al., 1999). De plus, il a été suggéré que Flt-1s peut former un complexe hétérodimérique avec KDR pouvant avoir un effet négatif sur la transduction de signal de KDR (Kendall et al., 1996). Étant donné que les récepteurs de VEGF sont associés à plusieurs pathologies, 1 'interférence de 1'action du VEGF par des antagonistes représente une stratégie attrayante cliniquement. En effet, des anticorps neutralisants humanisés qui interagissent avec le VEGF près du site de liaison Flt-1 et de KDR (Kim et al., 1993; Muller et al., 1997; Muller et al., 1998), et des SELEX (Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) dérivés molécules d'ARN (Jellinek et al., 1994) ont démontré une capacité à bloquer la croissance tumorale dépendante de la vascularisation des tissus normaux adjacents (Plate et al., 1994). De plus, il a été démontré qu'un anticorps monoclonal anti-KDR peut inhiber l'activité du VEGF et posséderait une activité anti-tumorale (Witte et al., 1998). Des études plus récentes portant sur le récepteur Flt-1 soluble, sur des fragments de VEGF, et sur des petites molécules inhibitrices de l'activité tyrosine kinase des récepteurs de VEGF, comme le PTK787/ZK222584 (Drevs et al., 2000) et le ZD4190 (Wedge et al., 2000) ont démontré leur capacité à inhiber l'angiogenèse in vivo (Gehlbach et al., 2003). Finalement, un oligonucléotide antisens anti-VEGF conçu pour inhiber l'expression de VEGF a bloqué la néovascularisation et la croissance de tumeurs implantées (Melinyk et al., 1996; Benjamin et al., 1997; Cheng et al., 2002). Cependant, il n'y a aucun antagoniste sélectif du récepteur Flt-1 disponible à ce jour. Dans la présente étude, le SP5.2 (NGYEIEWYSWVTHGMY), un nouveau peptide identifié en utilisant un criblage sur une librairie phagique, a été montré capable de se lier spécifiquement au Flt-1 tout en inhibant un large spectre d'évènements médiés par le VEGF. Aucune interaction croisée n'a été observée entre le SP5.2 et plusieurs récepteurs endothéliaux humains incluant le KDR et le récepteur à 1'ICAM-1. Des analyses par cytofluorimétrie ont démontré que le SP5.2 marqué à la fluorescéine était capable de se lier spécifiquement aux cellules endothéliales cérébrales primaires humaines (HCEC) stimulées au VEGF, alors qu'aucune interaction n'a été observée sur des HCEC non-stimulées ou des cellules de neuroblastôme humain (ShyY). De plus, le SP5.2 empêche la prolifération des cellules endothéliales ombilicales humaines primaires (HUVEC) induite par le VEGFt65 recombinant humain à un IC50 de 5J.1M. Il a aussi été démontré que le SP5.2 peut être un antagoniste de la prolifération induite par le VEGF ou le PIGF (Placenta Growth Factor) des HCEC, sans avoir d'effet sur la prolifération induite par le bFGF (basic Fibroblast Growth Factor). En utilisant un test de formation de capillaires in vitro, il a été démontré que l'activité angiogénique induite par le VEGF sur des HCEC en milieu Matrigel™ a complètement été inhibée par la présence de 10 J.l.M de SP5.2. Le peptide a aussi inhibé la formation de capillaires de HCEC exposées à un milieu préparé par des astrocytes hypoxiques ou par des cellules de glioblastome humain qui sont reconnues pour sécréter une grande quantité de VEGF. D'autres études ont démontré que le SP5.2 inhibe complètement la perméabilité à travers une monocouche de HCEC. Finalement, le SP5.2 est aussi capable d'inhiber la chémotaxie induite par le VEGF sur des HCEC, mais pas la migration de celles-ci si elle est induite par d'autres chemoattractants tels que IL-8. Des peptides à séquence aléatoire n'ont eu aucun effet. Pour explorer la possibilité d'utiliser le SP5.2 comme élément de ciblage, des conjugués recombinants et chimiques du SP5.2 avec des protéines rapportrices (Peroxidase ou p-galactosidase) ont été préparés. Ces protéines de fusion ont augmenté de façon significative le potentiel de liaison (200 fois pour le SP5.2-P-gal, et 400 fois pour le SP5.2- Peroxidase) au Flt-1 recombinant par rapport au peptide synthétique, ce qui suggère que des agents thérapeutiques ayant un activité de l'ordre du nanomolaire peuvent être développés et basés sur l'activité de SP5.2. Ce mémoire de maîtrise est divisé en quatre chapitres. Le premier chapitre présente une revue de littérature concise portant sur le facteur VEGF, ses récepteurs, ainsi que l'application des librairies phagiques. Le deuxième chapitre présente le matériel et les méthodes utilisées pour la sélection et l'analyse du peptide sélectionné. Le troisième chapitre décrit les résultats obtenus. Finalement, le quatrième chapitre présente une discussion et une conclusion reflétant l'analyse des principaux résultats obtenus au cours de ce projet de recherche.

Type de document: Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Ahmad, Darakhshan
Co-directeurs de mémoire/thèse: Alakhov, Valery (Supratek Pharma); Yurchenko, Ludmila (Supratek Pharma)
Mots-clés libres: peptide ; angiogenese ; recepteur ; vegf
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 15 mai 2014 18:24
Dernière modification: 18 déc. 2015 17:07
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/2118

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