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Neuroprotective mechanisms of standardized extracts of Bacopa monniera and their relevance in the treatment of Alzheimer’s and Parkinson’s diseases.

Singh, Manjeet (2013). Neuroprotective mechanisms of standardized extracts of Bacopa monniera and their relevance in the treatment of Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. Thèse. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Doctorat en biologie, 238 p.

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Résumé

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Les maladies d'Alzheimer (MA) et de Parkinson (MP) sont les deux formes les plus communes de maladies neurodégénératives liées à l'âge. Elles touchent des millions d'individus à travers le monde. Dans un premier temps, les caractéristiques pathologiques de la MA comprennent la déposition de plaques séniles extracellulaires composées du peptide d'amyloïde beta (AB) et des enchevêtrements neurofibrillaires extracellulaires, composés de la protéine tau hyperphosphorylée ainsi que de la perte neuronale. Dans un second temps, la MP est caractérisée par la perte sélective des neurones dopaminergiques au niveau de la substance noire compacta (SNpc) dans le cerveau et la déposition de l'alpha (a)-synucléine contenue dans les corps de Lewy. La composante génétique contribue à <10% des diverses formes familiales de la MA et de la MP et prés de 90% de MA et de MP des formes sporadiques. En Inde, de nombreuses plantes médicinales sont utilisées comme agents nootropes et toniques pour le cerveau dans le but de restaurer le déclin mental lié à l'âge. Le taux d'incidence entre l'âge et la MA dans les milieux ruraux d'Inde sont au moins trois fois plus faibles que les taux des populations américaines de référence. Cependant, la prévalence de la MP chez les indiens asiatiques est aussi trois fois inferieure à celle des caucasiens britanniques. Contrairement aux américains, il n'existe pas de lien entre l'âge et la perte des neurones du SNpc chez les indiens asiatiques. La Bacopa monniera (BM) est l'une des plus importante plante médicinale utilisée dans le système de médecine traditionnelle en Inde. Elle est utilisée comme agent nootrope et comme stimulant pour le cerveau dans le but de restaurer les déclins cognitifs liés à l'âge. Il a été rapporté que les bacosides, saponines triterpénoïdes, sont les constituants responsables de l'activité biologique de BM. Cependant, en dépit, de sa large utilisation comme stimulant cérébral, les détails des mécanismes neuroprotecteurs sur des modèles in vivo de la MA et de la MP restent à être étudiés. Le but du projet proposé était de cribler les mécanismes neuroprotecteurs de l'extrait de BM enrichi en composés Bacosides dans diverses toxines en fonction des modèles in vitro de la MA et de la MP. Notre hypothèse était que l'extrait de BM contenant des extraits de Bacosides permettrait d'augmenter la survie cellulaire, de réduire le stress oxydatif et les radicaux libres, de préserver les fonctions mitochondriales et de moduler de nombreuses voies de signalisation redox contre différentes neurotoxines. Notre premier objectif de recherche était de déterminer, si les extraits de BM peuvent protéger contre le peroxyde d'hydrogène (H202), l'acroléine, le 1-methyl-4-phenyl­ pyridinium iodide (MPP+) et le paraquat (PQ)& soldiquat (DQ) toxines qui induisent la mort neuronale. La toxicité du peptide d' Af3 est médiée par une variété de voies de signalisation incluant la génération d'H202 et des produits de la peroxydation lipidiques. L'acroléine est 1'un des sous-produits de la peroxydation lipidique le plus réactif. Le MPP+ est un inhibiteur du complexe 1 mitochondrial. Le PQ et le DQ, sont des herbicides bipyridyl avec une structure similaire au MPP+, ils sont communément utilisés dans les études réalisées sur des modèles in vitro et in vivo de la MP. L'utilisation de nombreux tests de cytotoxicité et de survie cellulaire tels que les tests LDH, XTT et Résazurin nous ont permis de montrer l'effet neuroprotecteur d'extraits standardisés de BM la toxicité contre de l'H202, l'acroléine, le MPP+ et le PQ molécules sur les cellules de neuroblastome humain, les SK­ N-SH et sur les cellules dopaminergiques de rat, les PC12. Dans le but de faire la différence entre les effets toxiques et proliférateurs des extraits de BM, nous avons réalisé le test de la lactate déshydrogénase (LDH) qui permet de mesurer l'intégrité de la membrane cellulaire et ainsi de quantifier la moyenne des cellules mortes. Nos résultats montrent que le prétraitement avec 50.0 J.tg/ml de BM, protège la lignée cellulaire dopaminergique SK-N­ SH contre la toxicité induite par le MPP+ et le PQ dans de nombreux test de survie cellulaire. Par ailleurs, nous avons aussi montré que les composés Bacosides sont impliqués dans la neuroprotection contre ces nombreuses toxines. Notre second objectif de recherche était d'étudier l'activité antioxydante de l'extrait de BM. Pour cela nous avons utilisé de nombreux tests fluorescents et des détections électrochimiques, nous avons démontré que l'extrait de BM dégrade l'H202 mais aussi réduit le niveau des espèces réactives à l'oxygène (EROs). L'extrait de BM protège aussi de la formation des anions superoxyde induits par le PQ dans les cellules SK-N-SH et les PC12. De plus, l'extrait de BM (2.5 J.tg/ml) protège de la réduction du glutathion (GSH) induite par le MPP+ en plus de réduire le niveau des protéines oxydées induites par l'H202 et l'acroléine. L'adaptation et la survie neuronale en réponse à un stress oxydatif dépendent de nombreux facteurs de transcription régulés par le potentiel redox. Ainsi, pour notre troisième objectif de recherche nous avons évalué la capacité de l'extrait de BM à moduler différentes voies de signalisation redox. L'utilisation de western-blot et de tests enzymatiques nous a permis de montrer que l'extrait de BM active la protéine kinase B (AKT) et le facteur nucléaire erythroid 2 (Nrf2) avec des concentrations respectives de 40.0 J.tg/ml et 10.0 -tg/ml, et augmentent l'activité de nombreuses enzymes antioxydantes de phase 2. Un prétraitement avec l'extrait BM (40.0 J.tg/ml) protège aussi de la diminution de la régulation des systèmes de défense antioxydants induite par le PQ et le DQ tel que y-glutamylcysteine synthetase (y-GCS) et de thioredoxine 1 (Trxl). Par ailleurs, un prétraitement avec l'extrait BM protège contre l'activation du facteur nucléaire kappaB (NF-KB), des protéines kinases activées par des agents mitogènes (MAPKs) et p66Shc et préserve le niveau de sirtuine 1, induit par l'H202 et l'acroléine dans les cellules SK-N­ SH. Ces résultats indiquent que l'extrait de BM peut moduler différentes voies de signalisation redox. De plus, il a été montré que les dysfonctions mitochondriales jouent un rôle important dans la pathophysiologie des MA et MP. D'ou pour notre dernier objectif nous avons étudié l'effet de l'extrait de BM sur différentes fonctions mitochondriales. À l'aide de tests fluorescents nous avons démontré que l'extrait de BMprotège contre le déclin du potentiel membranaire mitochondrial induit par l'H202, l'acroléine, et le MPP+. Nous avons montré par la méthode de semi-purification mitochondriale que l'extrait de BM (50.0 J-lg/ml) protège l'activité du complexe 1 mitochondrial contre le traitement MPP+. De plus, l'extrait de BM augmente l'activité de la NADH déshydrogénase mitochondriale. Ces résultats suggèrent que l'extrait de BM peut moduler et préserver les fonctions mitochondriales durant un stress oxydatif. En conclusion, notre étude contribue à une meilleure compréhension de nombreux mécanismes neuroprotecteurs de l'extrait de BM contre différentes neurotoxines, ce qui peut favoriser davantage possibilité dans son application thérapeutique en ciblant et modulant de nombreux mécanismes physiopathologiques impliqués dans la progression de la MA et de la MP.

Abstract

Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD) are the two most common age­ related neurodegenerative disorders affecting millions of people worldwide. Pathological hallmarks of AD include the deposition of extracellular senile plaques composed of beta amyliod peptides (Aj3), and intracellular neurofibrillary tangles, composed of hyperphosphorylated tau proteins and neuronal Joss. On the other hand PD is characterized by the selective Joss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta (SNpc) of the brain and deposition of alpha (a)-synuclein containing lewy's bodies (LBs). Genetic components contribute to < 10% offamilial variants of AD and PD and around 90% of AD and PD cases are sporadic. In India, several medicinal plants are used as nootropic agents and brain tonies to restore age-related decline in mental abilities. The incidence rates of the age-specifie AD in rural Indian are at least three times lower than those of an age-matched American reference population. Moreover, prevalence of PD in Asian Indians is also at least three times lower than British Caucasians and unlike the Americans there is no age-related Joss of SNpc neurons in Asian Indians. Bacopa monniera (BM) is one of the most important medicinal plants used in the Indian system of traditional medicine as a nootropic agent and brain tonie to restore age-related decline in cognitive abilities. Bacosides, the triterpenoid saponins have been reported to be active constituents responsible for the biological activity of BM. However, in spite of widespread use of BM extract as a brain tonie, the detailed neuroprotective mechanisms in in vitro models of AD and PD remain to be investigated. The aim of proposed investigation was to screen the neuroprotective mechanisms of BM extract enriched in Bacosides compounds in various toxins based in vito models of AD and VI PD. Our hypothesis was that BM extract containing Bacosides compounds will enhance cell survival, decrease oxidative stress and free radicals, preserve mitochondrial functions and modulate various redox-signaling pathways against various neurotoxins. Our first research objective was to determine whether BM extract can protect against hydrogen peroxide (H202), acrolein, 1-methyl-4-phenyl-pyridinium iodide (MPPl, and paraquat (PQ)/diquat (DQ)-induced neuronal cell death. Apeptide toxicity is mediated through a variety of downstream pathways including the generation of H202 and lipid peroxidation products. Acrolein is one of the most reactive by-products of lipid peroxidation. MPP+ is an inhibitor of the mitochondrial complex l. PQ and DQ are bipyridyl herbicides and with a similar structure to MPP+, are commonly used both in in vitro and in vivo models of PD. Using XIT and Resazurin based cell survival assays, we demonstrated the neuroprotective effects of the standardized extracts of BM against H202, acrolein, MPP+ and PQ/DQ-induced toxicity in human neuroblastoma SK-N-SH and rat dopaminergic PC12 celllines. To distinguish between toxicity and proliferation effects of the BM extracts, lactate dehydrogenase (LDH) assay which measures the cellular membrane integrity and is a mean of quantifying dead cells was also done. Our results show that a pre-treatrnent with 50.0 J.tg/ml BM extract protected the dopaminergic SK-N­ SH cell tine against MPP+ and PQ-induced toxicity in various cell survival assays. Furthermore, we showed that Bacosides compounds were involved in neuroprotection against various toxins. ln the second research objective we investigated the antioxidant activity of BM extract. Towards this, using various fluorescent dyes and electrochernical detection, we demonstrated that BM extract degraded H202 and decreased H202 and PQ/DQ-induced VII intracellular reactive oxygen species (ROS) levels. BM cxtract also prevented PQ/DQ­ induced superoxide anions generation in SK-N-SH and PCI2 cells. Additionally, BM extract (2.5 j.tg/ml) also prevented MPP+-induced intracellular reduced glutathione (GSH) depletion. Besicles, BM extract also decreased H202 and acrolein-induced protein oxidation. Adaptation and neuronal survival in response to oxidative stress depend on various cellular redox-regulated transcription factors. Hence, in the third research objective we assessed the ability of the BM extract to modulate different redox-signaling pathways. Using western lot analysis and enzymatic assays, we demonstrated that BM extract alone activated the activated protein kinase B (AKT) and nuclear erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) at 40.0 j.tg/ml and 1 0.0 j.tg/ml respective!y, and increased the activities of various phase 2 antioxidant enzymes. BM pre-treatment (40.0 j.tg/ml) also prevented the PQ/DQ-induced down regulation of the antioxidant defence systems such as y-glutamylcysteine synthetase (y-GCS) and thioredoxinl (Trxl) levels. Moreover, BM pre-treatment prevented the H202 and acrolein-induced activation of the nuclear factor-kappaB (NF-KB), mitogen activated protein kinases (MAPKs) and p66Shc and preserved Sirtuinl leve! in SK-N-SH cells. These results indicate that BM extract can modulate different redox-signaling pathways. Since mitochondrial dysfunctions have also been shown to play a pivotai role in AD and PD pathophysiology, in the final objective we investigated the effect of BM extract on various mitochondrial functions. Using various fluorescent dyes, we demonstrated that BM extract prevented the H202, acrolein, and MPP+-induced decline in mitochondrial membrane potential (MMP) levels. Using semipurifed mitochondrial fraction, we showed that BM extract (50.0 j.tg/ml) also preserved mitochondrial complex1 activity against MPP+ treatment. Additionally, BM extract increased mitochondrial NADH dehydrogenases activity. These results suggest that BM extract can modulate and preserve mitochondrial functions during oxidative stress. Takcn together our work contributes to a better understanding of the various neuroprotective mechanisms underlying BM extract against various neurotoxins and this may further open up the possibility of its therapeutic application in targeting and modulating the various pathophysiological mechanisms involved in the progression of AD and PD.

Type de document: Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Ramassamy, Charles
Informations complémentaires: Résumé avec symboles
Mots-clés libres: Neuroprotecteur ; bacoside ; acroleine ; peroxyde ; hydrogene ; paraquat ; mmp+ ; diquat ; polyphenol
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 06 nov. 2015 16:45
Dernière modification: 06 nov. 2015 16:45
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/2038

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