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Développement de stratégies pour la production d'un biopesticide à base de Bacillus thuringiensis var. Kurstaki HD-1 avec une forte activité insecticide en utilisant les eaux usées d'industrie d'amidon comme matière première.

Vu, Dang Khanh (2009). Développement de stratégies pour la production d'un biopesticide à base de Bacillus thuringiensis var. Kurstaki HD-1 avec une forte activité insecticide en utilisant les eaux usées d'industrie d'amidon comme matière première. Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en sciences de l'eau, 362 p.

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Résumé

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Les insectes nuisibles réduisent considérablement les rendements des cultures agricoles et sylvicoles à travers le monde. Des biopesticides commerciaux à base de Bacillus thuringiensis (Bt) ont été utilisés pour la gestion de ces ravageurs. Le facteur le plus important qui fait de Bt un biopesticide commercial est sa remarquable capacité à produire de grandes quantités de protéines larvicides (connues sous le nom de protéines Cry ou delta-endotoxines). Après auto-assemblage, ces protéines forment des corps d'inclusions cristallines lors de la sporulation du bacille. Toutefois, l'utilisation de bioinsecticides à base de Bt est limitée en raison des coûts élevés de leur production. Dans cette optique, il est important de déterminer les possibilités d’utiliser des matières premières alternatives à bas prix pour obtenir industriellement Bt. À ce propos, des recherches antérieures ont démontré que des eaux usées d'industrie d’amidon (SIW) peuvent être utilisées comme matière première pour la production d’insecticides bactériens à base de Bt var kurstaki HD-1 (Btk HD-1). Des travaux ont montré que l’activité insecticide ou entomotoxicité (Tx) de Bt obtenu dans les SIW contre la tordeuse des bourgeons de l'épinette (TBE) (Choristoneura fumiferana) est plus élevée que celle de Bt produit dans les boues ou dans des milieux semi-synthétiques. Toutefois, la recherche systématique sur la maximisation de Tx du bouillon fermenté ou Tx de suspension du culot (bouillon fermenté concentré par centrifugation) lors de l'utilisation des SIW comme matière première n’a pas été totalement explorée. Par conséquent, l'objectif principal des présents travaux est l'application de différentes stratégies de production pour améliorer l’efficacité contre la TBE de Btk HD-1 lors de sa production en utilisant les SIW comme matière première pour la fermentation. Au cours d’une première approche, quatre méthodes ont été appliquées pour accroître les éléments nutritifs dans les SIW pour la production des bioinsecticides avec une Tx plus élevée contre la TBE: (1) l'ajout de nutriments (acide acétique et hydroxyde d'ammonium) dans les SIW au cours de la fermentation, sous la forme de différents agents de contrôle du pH; 2) évaluation de l’effet de différentes concentrations de solides totaux des SIW pour la fermentation; (3) addition de sources appropriées de carbone/azote dans les SIW pour la fermentation; (4) fermentation en Fed-batch. L'application de ces méthodes a entraîné une concentration significativement plus élevée en delta-endotoxines et des valeurs de Tx des bouillons fermentés ainsi que des Tx de suspensions des culots par rapport au contrôle (SIW sans modification). Les valeurs de Tx des bouillons fermentés ont été augmentées, passant de 15,3x106 Spruce Budworm Unit/ml (SBU/ml) dans SIW du contrôle à 17,8-18,5x106 (SBU/ml) lorsque les quatre méthodes ont été appliquées, alors que les valeurs de Tx des suspensions des culots (10 fois plus concentré que le bouillon fermenté et obtenu par concentration par centrifugation de ce bouillon) ont été augmentées de 20,9x106 (SBU/ml) dans les SIW du contrôle à 25,8-27,4x106 (SBU/ml) après l’application des procédés en question. Il a alors été observé que : (1) avec utilisation d'une des quatre méthodes, les valeurs obtenues de Tx des suspensions des culots sont élevées et pourraient être utilisées pour d'autres recherches concernant la formulation finale; l'augmentation des concentrations en delta-endotoxines ou en spores pourraient ne pas augmenter nécessairement et proportionnellement les valeurs de Tx (bouillons fermentés ou suspensions des culots); (3) Les activités spécifiques des delta-endotoxines ou des spores contre la TBE changent en fonction du milieu de fermentation. La seconde approche avait pour objectif d’étudier l'action synergique des chitinases sur l’action des delta-endotoxines et des spores pour augmenter la valeur de Tx. Les résultats ont démontré que l'enrichissement des SIW par de la chitine colloïdale à une concentration de 0,2%, p/v (optimum) et en utilisant ce mélange (désigné comme SIWC) pour l’obtention de Btk HD-1, stimule la production de chitinases par ce bacille alors qu'il n'en produit pas par croissance dans les SIW contrôles (sans fortification avec chitine colloïdale). Les concentrations en cellules, en spores et en delta-endotoxines du bouillon fermenté des SIWC étaient inférieures à ceux des contrôles. Toutefois, les valeurs maximales des Tx du bouillon fermenté (17,1x106 SBU/ml) et de suspension du culot (26,7x106 SBU/ml) des SIWC obtenus après 36 h de fermentation (au lieu de 48 h dans le contrôle) ont été significativement plus élevées que les valeurs maximum des Tx du bouillon fermenté (15,3 x106 SBU/ml) et de suspension du culot (20,5 x 106 SBU/ml) du contrôle, respectivement. Les résultats confirment donc le rôle des chitinases comme agents de synergie pour accroître les Tx tout en réduisant le temps de production de 48 à 36 heures. En troisième lieu, il a été constaté que le surnageant du bouillon fermenté obtenu par production de Btk HD-1 dans les SIWC contient de la Zwittermicine A (test qualitatif). Un processus d'ultrafiltration a donc été appliqué en utilisant une membrane de 5 kDa pour fractionner et récupérer des chitinases (et d'autres composants de haut poids moléculaire) et la Zwittermicine A (un antibiotique de 396 Da). Le rétentat obtenu (contenant une haute activité chitinolytique et d'autres composants) et le filtrat (contenant la Zwittermicine A) ont été mélangés avec la suspension du culot des SIWC à différents ratios. Le potentiel entomotoxique des ces mélanges a été estimé par bioessais contre la TBE afin de déterminer quels mélanges peuvent fournir les valeurs de Tx les plus élevées et comment récupérer un pourcentage de Tx élevé à partir de la Tx totale présente dans le bouillon fermenté. Il a été constaté que le mélange « suspension du culot avec retentate » dans un ratio volumétrique de 1:4 (1Pel4Ret) a donné la plus haute récupération de Tx (65,1% de la Tx totale du bouillon fermenté) avec le plus gros volume de 5 L (1 L suspension du culot et 4 L rétentat). Ce mélange contient des concentrations en spores, en deltaendotoxines et en activité chitinolytique respectivement de 3,24 x 108 (CFU/ml), 1,09 (mg/ml) et 69,3 (mU/ml). La valeur de la Tx de ce mélange a été de 22,8 x 106 (SBU/ml) et donc le plus efficace en ratio volumétrique du mélange en termes de synergie d'action des chitinases sur les delta-endotoxines, les spores et sur la Tx. Ce mélange peut donc être un candidat pour une formulation finale de bioinsecticide. De même, le mélange « suspension du culot et filtrat » dans un ratio volumétrique de 1:2 (1 L suspension du culot et 2 L filtrat) est le ratio volumétrique le plus efficace en termes d'action synergique de la Zwittermicine (dans filtrat) sur les deltaendotoxines les spores et sur la Tx. Ce mélange contient respectivement des concentrations en spores, en delta-endotoxines, en activité chitinolytique et en valeur de Tx de 5,40 x 108 (CFU/ml), 1,82 (mg/ml), 10,2 (mU/ml), et de 22,8 x 106 (SBU/ml). Cependant, ce mélange est moins efficace en termes de récupération de Tx du bouillon fermenté des SIWC par rapport au mélange de 1 partie de suspension du culot et 4 parties de rétentat. Enfin, six différents milieux semi-synthétiques, des SIW et des boues secondaires ont été utilisées pour obtenir Btk HD-1. Les concentrations en spores, en delta-endotoxines et en activité insecticide obtenus dans ces expériences ont été déterminées et les relations possibles entre ces paramètres, analysées. La relation entre la concentration en delta-endotoxines et celle en spores dans les différents milieux suit l'équation suivante: « concentration de delta-endotoxines = a (concentrations de spores)b » avec b > 0, R2 ≥ 0.90. Les valeurs des constantes "a et b" sont les caractéristiques de chaque milieu. La relation entre SpTx-spore (Tx spécifiques par 1000 spores) et la concentration en spores suit strictement l'équation: « SpTx-spore = c (concentrations de spores)d « avec d < 0, R2 > 0.98. Cette relation conduit à la remarque que des spores de Btk HD-1 produites au début de la période de fermentation peuvent-être plus toxiques que celles produites en fin de fermentation et ce, indépendamment du type de milieux. Btk HD-1 peut par ailleurs produire des agents de synergie (protéines insecticides végétatives -Vip3A, Zwittermicine A, etc), à plus forte concentration au début de la période de fermentation; Ces agents contribuant à la valeur de Tx. La relation entre Tx et la concentration en delta-endotoxines suit une équation linéaire semi-logarithmique linéaire: « Ln (Tx) = m (concentration de delta-endotoxin) + h »; ‘m’ étant la pente et ‘h’ l’ordonnée à l'origine. Lors d’un examen plus approfondi des résultats en termes de valeurs de Tx, de spores, de concentration en delta-endotoxines des suspensions des culots (complexe spores et delta-endotoxines) de ces milieux, il a été constaté que la différence entre les valeurs de Tx à diverses concentrations en spores ou en delta-toxine est due seulement à des facteurs solubles; Ces facteurs étant présents dans les surnageants des bouillons fermentés centrifugés.

Type de document: Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Tyagi, Rajeshwar Dayal
Co-directeurs de mémoire/thèse: Valéro, José R.
Informations complémentaires: Résumé avec symboles
Mots-clés libres: eaux usées d’industrie d’amidon; Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD-1; entomotoxicité; biopesticides; bioconversion; production; insecticide; développement ; stratégie; delta-endotoxine; carbone; azote; culture fed-batch; activité des chitinases; action synergique; tordeuse des bourgeons de l'épinette; chitinases; ultrafiltration; Zwittermicine A; pores; boues secondaires
Centre: Centre Eau Terre Environnement
Date de dépôt: 11 févr. 2014 16:19
Dernière modification: 17 mars 2016 17:55
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/2017

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