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Utilisation des boues des usines de traitement comme moyen alternatif pour la production de l'insecticide microbien Bacillus Thuringiensis.

Tirado Montiel, Maria de Lourdes (1997). Utilisation des boues des usines de traitement comme moyen alternatif pour la production de l'insecticide microbien Bacillus Thuringiensis. Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en sciences de l'eau, 242 p.

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Résumé

L'utilisation des boues d'épuration comme milieu alternatif de culture pour la production du biopesticide B. thuringiensis a été évaluée en tenant compte que celles-ci contiennent des éléments pouvant soutenir la croissance, la sporulation et la production de la δ- endotoxine. Dans ces expériences la souche employée était B. thuringiensis var. kurstaki HD-l qui est la bactérie la plus utilisée pour lutter contre un grand nombre des larves de lépidoptères. Au Québec elle est employée pour contrôler la tordeuse des bourgeons de l'épinette. La première étape de ce projet consistait à tester des boues de différents types et origines. Ainsi, les expériences ont été réalisées avec la boue primaire de Valcartier (ValP), la boue secondaire de Black Lake (BLS), la boue secondaire digérée aérobiquement de Black Lake (BLDA), la boue secondaire de Sainte Claire (SCS), la boue secondaire de Beauceville (BVS), la boue seéondaire d'une usine de pâtes et papiers (PPS) et la boue secondaire du réacteur à membranes de cette même usine de pâtes et papiers (PPRMS). Comme les conditions d'utilisation peuvent avoir une influence sur développement de la bactérie, chaque boue a été utilisée sous trois conditions de préparation, c'est-à-dire, sans prétraitement, avec prétraitement (hydrolyse à l'acide sulfurique) ou le surnageant seul des boues hydrolysées obtenu après une centrifugation. Le temps nécessaire pour atteindre la sporulation maximale de B. thuringiensis dans les boues a varié selon la préparation des boues, ce qui a eu une influence sur la disponibilité des nutriments. Dans les boues sans prétraitement la durée était de dix à onze jours. En utilisant les boues prétraitées, le temps a été réduit de huit à neuf jours, et avec les surnageants la durée était de quatre à six jours. Le pH initial de la boue joue un rôle important sur le développement de la bactérie; dans ces expériences en utilisant la boue primaire de Valcartier (ValP) sans prétraitement (pH=5.5), la bactérie n'a pas été capable de se développer, donc il a été constaté qu'un pH initial près de la neutralité peut améliorer la performance des boues. Le potentiel entomotoxique des complexes spores-cristaux obtenus dans les fermentations réalisées avec les différentes boues, a été estimé par des bioessais en utilisant des larves de la tordeuse des bourgeons de l'épinette comme insecte cible. L'hydrolyse de boues a eu un impact positif sur le potentiel entomotoxique, une activité plus élevé a été obtenue (4100 UI/µL) avec la boue secondaire de Black Lake (BLS) qu'avec le milieu de référence (farine de soja, 3800 UI/µL), tandis que l'utilisation des surnageants ne s'avère pas recommandable parce que les potentiels entomotoxiques des complexes spores"' cristaux ont présenté des valeurs inférieures à celles rencontrés en utilisant les boues non hydrolysées et les boues hydrolysées. L'influence du pH et de la température sur la croissance, la sporulation et la production de la δ-endotoxine par B. thuringiensis var. kurstaki HD-l ont été étudiées en utilisant la boue secondaire de Jonquière (JS). L'effet de ces deux paramètres a été évalué dans une première expérience en réalisant des fermentations entre 30 °C et 36 °C et en même temps en utilisant cette boue hydrolysée à différents pH. La deuxième expérience consistait à maintenir constant le pH pendant toute la fermentation à l'aide des tampon TRIS et PBS. Une troisième expérience consistait à appliquer un choc thermique après avoir atteint la phase de croissance exponentielle de façon à promouvoir la sporulation de la bactérie. En général, c'est entre 30 °C et 32 °C que les potentiels entomotoxiques et les concentrations des complexes spores-cristaux plus élevés sont obtenus. Pour le pH, au moins pour la boue secondaire de Jonquière, l'hydrolyse ne semble pas avoir une influence sur le potentiel entomotoxique des complexes spores-cristaux obtenus. Donc en utilisant cette boue comme milieu de culture il ne serait pas nécessaire d'effectuer l'hydrolyse, ce qui réduit le coûts de production du biopesticide. La croissance, la sporulation et la production de la δ-endotoxine ont été affectées en utilisant les températures de 34 °C et 36 °C comme le démontrent les faibles taux maximaux spécifiques de croissance, les pourcentages de sporulation et les potentiels entomotoxiques des produits obtenus à ces températures. Il est donc fortement recommandable de ne pas réaliser les fermentations à ces températures et de travailler plutôt entre 30 °C et 32 °C. Le contrôle du pH réalisé à l'aide des tampons pendant les fermentations, a eu un impact bénéfique sur la croissance, la sporulation et la production de la δ-endotoxine. Les pourcentages de sporulation et les potentiels entomotoxiques des échantillons de la boue de Jonquière contenant les tampons ont augmenté par rapport à ceux de l'échantillon sans contrôle du pH. Il serait souhaitable de réaliser des études plus approfondies pour évaluer l'influence d'un choc thermique plus sévère que celui réalisé dans ces expériences où nous n'avons pas trouvé des améliorations au niveau des pourcentages de sporulation ou du potentiel entomotoxique. L'influence de l'agitation sur la croissance, la sporulation et la production de la δ-endotoxine par B. thuringiensis a été étudiée en réalisant des expériences à quatre niveaux d'agitation, soit à 50 rpm, 150 rpm, 250 rpm et 350 rpm. Il a été constaté que quand les conditions d'aération ne sont pas adéquates (50 rpm), la croissance de la bactérie peut devenir lente et la sporulation inhibée, ce qui affecte le potentiel entomotoxique du complexe spores-cristaux. C'est à 250 rpm que le potentiel entomotoxique plus élevé a été obtenu et en même temps les résultats ont démontré que le niveau d'agitation ne peut pas être augmenté indéfiniment, car le potentiel entomotoxique des complexes spores-cristaux obtenus à 350 rpm présente une valeur inférieure à celles obtenus à 250 rpm; ce résultat peut s'expliquer par une inhibition par excès du substrat, dans ce cas de l'oxygène. La culture de la bactérie dans un bioréacteur où les conditions d'aération peuvent être contrôlées pourrait aider à clarifier ce point. La boue secondaire de Black Lake (BLS) a été employée afin d'évaluer l'influence que l'addition des sources de nutriments peut avoir sur la croissance, la sporulation et la production de la δ-endotoxine par B. thuringiensis. Le glucose a été choisi comme source additionnelle de carbone et l'extrait de levure comme source d'azote et de vitamines. Initialement la boue a été enrichie de glucose, dont les concentrations variaient entre 40 mg/L et 200 mg/L. Il a été observé une réduction du temps nécessaire pour atteindre la sporulation maximale dans les échantillons additionnés de glucose (5 jours) par rapport à l'échantillon qui n'en contenait pas (10 jours) et aussi une augmentation du pourcentage de sporulation dans les échantillons contenant le glucose. Les potentiels entomotoxiques se sont aussi améliorés à mesure que la concentration du glucose a augmenté. Ils ont varié de 3300 UI/µL pour la concentration plus faible de glucose employée (40 mg/L) jusqu'à 5300 UI/µL pour la concentration de glucose la plus élevée ajoutée à la boue (200 mg/L). L'addition de l'extrait de levure (40 mg/L) en plus du glucose, a augmenté les potentiels entomotoxiques des complexes spores-cristaux obtenus, entre 3500 UI/µL et 6600 UI/µL. Le temps pour atteindre la sporulation maximale est resté le même que dans les expériences réalisées seulement avec l'addition du glucose (5 jours). Ces expériences ont montré qu'en variant la composition de la boue par l'addition de certains substrats, sa performance pour soutenir la croissance, la sporulation et la production de la δ- endotoxine par B. thuringiensis peut être améliorée. La stabilité des caractéristiques génétiques au niveau des gènes qui codent pour l'activité insecticide des cristaux produits par B. thuringiensis var. kurstaki HD-l, quand la bactérie a été cultivée dans des boues d'épuration, a été vérifiée par l'utilisation de la polymérisation en chaîne (PCR) en utilisant des amorces spécifiques pour chacun des gènes. Dans tous les échantillons analysés, les gènes CryIA(a), CryIA(b) et CryIA(c) qui codent pour l'entomotoxicité des cristaux produits pendant la sporulation chez cette variété, ont été identifiés. Ce fait indique que B. thuringiensis peut être cultivé dans les boues d'épuration sans affecter ses caractéristiques génétiques au niveau de ces trois gènes. L'utilisation des boues d'épuration comme milieu de culture pour la production du biopesticide B. thuringiensis semble une alternative intéressante du point de vue de leur recyclage. D'un autre coté, l'utilisation des boues d'épuration pour la production de ce bioinsecticide peut aider à réduire ses coûts de production, ce qui aidera à augmenter son utilisation pour contrôler certains insectes nuisibles. Des expériences en utilisant d'autres souches de B. thuringiensis pourraient augmenter le spectre d'utilisation des boues comme milieu de culture. Les résultats obtenus au cours de ces recherches ont fait l'objet d'une demande de brevet international ainsi qu'aux États Unis. Le brevet international étant déjà accepté.

Type de document: Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Tyagi, Rajeshwar Dayal
Co-directeurs de mémoire/thèse: Valéro, José
Mots-clés libres: boue; insecticide microbien; usine d’épuration; bioinsecticide; Bacillus thuringiensis
Centre: Centre Eau Terre Environnement
Date de dépôt: 18 févr. 2014 19:05
Dernière modification: 17 mars 2016 15:57
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/1989

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