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Étude des deux gènes de la famille Nramp chez Dictyostelium discoideum

Cortes, Laetitia (2006). Étude des deux gènes de la famille Nramp chez Dictyostelium discoideum Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 143 p.

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Résumé

Les protéines de la famille Nramp (Natural Resistance-Associated Macrophage Protein) sont des transporteurs de cations divalents et de protons de l'extérieur de la cellule vers le cytoplasme. Des membres de la famille Nramp ont été caractérisés chez des eucaryotes et des procaryotes, où ils sont appelés MntH (transporteur de manganèse dépendant du proton). Des analyses phylogénétiques suggèrent que cette famille a émergé chez les procaryotes où ces transporteurs participent à l'homéostasie de certains cations divalents et peut-être à la virulence de certains pathogènes. Un gène mntH aurait été transféré au noyau eucaryote lors de l'endosymbiose à 1'origine des mitochondries pour donner le gène eucaryote Nramp ancestral, dont la duplication aurait conduit à la divergence d'un Nramp «prototype» (proche du gène bactérien) et d'un «archétype» {présent uniquement chez les eucaryotes). L'archétype a persisté et a été dupliqué chez les vertébrés mais on trouve plusieurs copies de prototypes chez les levures, des mousses et certains organismes unicellulaires. L'amibe sociale Dictyostelium discoideum possède un archétype (DdNR2) et un prototype (DdNRJ), et représente un modèle de phagocyte ancestral. L'archétype Nramp étant associé au transport permettant d'évacuer certains cations du phagosome suite à un repas phagocytaire, on peut se demander si cette spécialisation résulte de la duplication/divergence du gène Nramp ancestral. Notre étude visait donc à déterminer le rôle physiologique des homologues Nramp de D. discoideum et vérifier l'hypothèse leur association à la membrane du phagosome. L'approche a consisté en plusieurs volets, que nous souhaitions appliquer à chacun des deux gènes. Toutefois, devant les difficultés techniques, nous nous sommes concentrés sur 1'étude du prototype DdNRJ. Le premier volet visait à cloner et exprimer une version écourtée de DdNRl dans E. coli, mais aucune expression n'a pu y être détectée dans les conditions testées. Le deuxième volet avait pour but de sous cloner les versions écourtée et pleine longueur de DdNRl pour expression future dans Dicty. En troisième objectif, nous voulions inactiver chez D. discoideum chacun des gènes Nramp par double recombinaison homologue pour déterminer le phénotype associé, puis complémenter la mutation en y restaurant une copie fonctionnelle. Une construction pour inactiver le gène DdNRJ a été créée contenant une cassette de résistance à la blasticidine, puis introduite par électroporation dans D. discoideum. Plusieurs clones résistants ont été obtenus, mais une copie du gène sauvage a pu y être détectée par Southem blot. En parallèle, un antisérum spécifique de lapin ayant été produit et vérifié dans le laboratoire contre la partie N-terminale de DdNRl, nous avons pu l'utiliser pour déterminer son (ses) site(s) d'expression chez D. discoideum par immunofluorescence indirecte in situ. Les résultats préliminaires suggèrent qu'elle serait localisée à la membrane plasmique.

Type de document: Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Cellier, Mathieu
Mots-clés libres: gene ; proteine
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 26 sept. 2013 14:01
Dernière modification: 08 déc. 2015 14:53
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/171

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