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Étude structurale du récepteur de l'urotensine-II et caractérisation du site de liaison

Boivin, Stéphane (2008). Étude structurale du récepteur de l'urotensine-II et caractérisation du site de liaison Thèse. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Doctorat en biologie, 137 p.

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Résumé

Les récepteurs à 7 passages transmembranaires couplés aux protéines G (RCPGs) constituent, par leur complexité et leur diversité, une cible intéressante pour le développement d'outils pharmacologiques. Le récepteur UT (UT) fait partie de cette grande famille et est impliqué dans la régulation de l'activité biologique du plus puissant peptide vasoconstricteur identifié à ce jour chez l'homme, l'urotensine-11 (U-11). Le récepteur UT ainsi que U-11 sont, entre autres, présents au niveau du système cardiovasculaire humain. Tous deux représentent de nouvelles cibles intéressantes pour le développement d'outils pharmacologiques utiles pour étudier la physiologie et certaines pathologies du système vasculaire. Cependant, les mécanismes moléculaires responsables de l'activation complète ou partielle de UT sont encore loin d'être clairement élucidés. Étant donné l'intérêt thérapeutique que peut présenter le développement d'agonistes et d'antagonistes sélectifs pour ce récepteur, la compréhension de ces mécanismes constitue un enjeu majeur. Une meilleure compréhension des mécanismes d'activation de UT implique l'identification de son domaine de liaison et 1'élucidation de sa structure tridimensionnelle. Cependant, la caractérisation structurale des récepteurs transmembranaires heptahélicaux, dont UT, demeure une tâche fastidieuse à cause de leur faible solubilité en général et de forte taille, sans oublier le risque que représente la dénaturation lors des étapes de purification. Ceci rend donc leur analyse structurale par des voies classiques, telles que la RMN et la cristallographie, très complexe voire impossible. Depuis les années 2000, une voie alternative a été utilisée pour caractériser par RMN la structure de grosses protéines. Cette nouvelle approche est basée sur l'analyse des segments individuels ou des domaines structuraux de la protéine, c'est-à-dire les boucles intra- et extracellulaires et/ou les segments transmembranaires dans le cas d'une protéine membranaire tel un RCPG. Cette technique a d'ailleurs été utilisée pour élucider avec succès la structure de la rhodopsine bovine et de la bactériorhodopsine. Plus précisément, la caractérisation structurale de tous leurs domaines structuraux par RMN et leur juxtaposition subséquente a permis d'élucider la structure complète des ces protéines membranaires dans leur forme native alors qu'auparavant seule leur structure cristallographique avait été décrite. Ces études suggèrent que la structure secondaire des domaines transmembranaires ainsi que des boucles cellulaires des RCPGs est stabilisée par des interactions à courtes distances gouvernées par la structure primaire rendant possible leur caractérisation structurale totale par le biais de l'analyse de sous fragments. De plus, une analyse similaire de la myohémérythrine, une protéine membranaire n'appartenant pas au RCPG, suggère que cette méthodologie ne se limiterait pas uniquement à l'étude structurale des RCPGs, mais pourrait être appliquée à l'étude de l'ensemble des protéines membranaires. Cette stratégie offre ainsi une approche très intéressante pour l'étude structurale de UT. Mon projet de doctorat avait pour but de caractériser le complexe U-IIIUT d'abord en identifiant le rôle de certains domaines structuraux de UT dans le processus de reconnaissance et d'activation en relation avec U-11, et ensuite en apportant des données sur la structure tridimensionnelle de ces domaines. Cette étude apporte donc de nouvelles données qui contribuent à une meilleure connaissance générale du complexe U-11/UT ce qui pourrait représenter un atout supplémentaire pour le développement et/ou le raffinement d'outils pharmacologiques destinés à l'étude du système cardiovasculaire. Elle contribue également à une meilleure compréhension structurale des RCPGs qui, malgré leur importance biologique, demeurent à ce jour peu caractérisés. Les objectifs du projet de recherche ont été de 1) cibler et développer par synthèse peptidique des segments de UT représentant des domaines structuraux susceptibles d'interagir avec U-11, 2) déterminer leur capacité à interagir avec des ligands connus de UT à l'aide de la résonance plasmonique de surface (RPS), et 3) caractériser par CD, RMN et par modélisation moléculaire l'arrangement tridimensionnel des domaines jouant un rôle clef dans le complexe U-II!UT. Ainsi, la réalisation de ce projet a reposé sur l'utilisation combinée d'approches expérimentales originales basées sur des méthodes chimiques et spectroscopiques couplées à des techniques de modélisation moléculaire reposant sur des données théoriques. À cet égard, cinq domaines structuraux ont été construits par synthèse peptidique en phase solide : trois boucles extracellulaires (EC-1, EC-11 et EC-III) et deux segments transmembranaires (TM-III et TM-IV). Par la suite, l'affinité de ces domaines pour différents ligands de UT, soit deux agonistes (U-11 et URP) et un antagoniste (Urantide), a été déterminée par RPS. Cette étude a permis d'établir expérimentalement la participation de la boucle extracellulaire-11 du récepteur UT dans la liaison sélective des agonistes U-11 et URP, et de l'antagoniste Urantide. Les résultats de cette étude ont également démontré que contrairement à la boucle extracellulaire-11, la boucle extracellulaire-III ne peut lier sélectivement que les agonistes U-11 et URP. Ces résultats suggèrent donc que U-11 et Urantide lient EC-11 selon un mécanisme commun alors que la liaison avec EC-III jouerait davantage un rôle clé dans le processus d'activation du récepteur UT. Ainsi, il est possible de concevoir que de puissants antagonistes pourraient être développés en produisant des ligands de haute affinité ciblant la boucle EC-111. L'arrangement structural des domaines extracellulaires­ II et -III a par la suite été caractérisé à l'aide du dichroïsme circulaire, de la RMN et de la modélisation moléculaire. De plus, l'arrangement moléculaire de ces domaines a pu être déterminé dans un environnement micellaire. Nos résultats confirment la propension des fragments peptidiques de UT à adopter une conformation moléculaire organisée en solution. Plus précisément, les résultats ont montré que les domaines EC-II et EC-III adoptent une géométrie spatiale bien définie au niveau de l'interface des domaines transmembranaires et des boucles extracellulaires pouvant mettre en évidence des éléments structuraux et chimiques essentiels pour la liaison de U-II. Enfin, une étude complémentaire explorant par RMN le complexe EC-IIIIU-II et EC-IIIU-II a été réalisée afin d'identifier des interactions se manifestant entre des domaines synthétiques de UT et U-II. Le titrage par RMN du complexe EC-IIIU-II et EC-IIIIU-II a permis de suggérer certains déterminants ou résidus-clés composant le site de liaison de U-II. Nos travaux visant à identifier et à caractériser le site de liaison de U-II ont donc conduit à une meilleure compréhension des bases moléculaires de l'activation de UT par U-11, mais également par l'URP et par l'Urantide. Enfin, notre étude permettra de mieux définir certaines propriétés de UT et pourraient mener à la conception de nouveaux outils moléculaires intéressants.

Type de document: Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Fournier, Alain; Davoust, Daniel (Université de Rouen)
Informations complémentaires: Cette thèse a également conduit à un Ph.D. en chimie de l'Université de Rouen
Mots-clés libres: Recepteur ; couple ; proteine ; proteine ; G ; rcpgs
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 19 juin 2017 19:44
Dernière modification: 19 juin 2017 19:44
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/143

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