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Effets des propriétés rhéologiques sur la fermentation des eaux usées et des boues d'épuration par Bacillus thuringiensis var. kurstaki et sur le développement de biopesticides en suspensions aqueuses concentrées.

Brar, Satinder Kaur (2006). Effets des propriétés rhéologiques sur la fermentation des eaux usées et des boues d'épuration par Bacillus thuringiensis var. kurstaki et sur le développement de biopesticides en suspensions aqueuses concentrées. Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en sciences de l'eau, 682 p.

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Résumé

Ce projet de recherche Vise à évaluer les possibilités de développer des procédés de production par fermentation de biopesticides à base de Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD-l (Bt) et ce, en utilisant des eaux usées et/ou des boues d'épuration comme milieux de culture. Ces substrats alternatifs sont de riches sources de nutriments qui peuvent être exploités pour cultiver Bt et produire des biopesticides à haute valeur ajoutée. Les propriétés rhéologiques des bouillons constituent un élément clé devant être pris en considération lors de la fermentation des boues et de la formulation des biopesticides. Les études rhéologiques (viscosité et taille des particules) réalisées avec plusieurs types de substrats de fermentation (boues primaires, secondaires et mixtes, eaux usées de l'industrie de l'amidon, boues pré-traitées par hydrolyse ou par stérilisation) ont permis de mettre en évidence que des lois exponentielles et de puissance étaient préférentiellement suivies par les boues hydrolysées fermentées en comparaison avec les boues brutes fermentées, alors qu'une augmentation exponentielle de la viscosité a été observée avec la hausse de la concentration en solides. Les tests ont démontré que les boues secondaires contenant 25 g/L de solides et les eaux usées d'amidon sont rhéologiquement compatibles pour la fermentation et le développement de la formulation. Les milieux alternatifs fermentés ont montré un comportement pseudoplastique (ayant une viscosité diminuant avec la vitesse de l'écoulement ou le taux de cisaillement) et un comportement thixotropique (présentant une viscosité diminuant avec la durée de l’écoulement ou la durée d'application de la contrainte de cisaillement). Parallèlement, les boues secondaires hydrolysées ont montré un profil rhéologique amélioré par rapport aux boues non hydrolysées, résultant en un bouillon de fermentation avec une forte entomotoxicité et une formulation stable. Quant aux boues non hydrolysées, suite à l'addition de Tween 80, elles ont aussi présenté des profils rhéologiques mieux adaptés pour les fermentations de substrats à des concentrations de 25 à 30 g solides totaux par litre. D'ailleurs, pour les boues hydrolysées, la diminution de la taille des particules présentait une bonne corrélation avec l'augmentation de l'entomotoxicité, alors que la distribution de la taille des particules se situait dans la région inférieure de 0,2 à 12 µm. En fait, la courbe de distribution de la taille des particules des formulations faites à partir de la fermentation de boues hydrolysées était comparable à celle de la formulation commerciale.[O] Des études complémentaires ont été réalisées sur les récoltes des bouillons fermentés de Bt, le traitement en aval et la formulation. Des valeurs de pH de 4 et 5 et une température de 20°C sont optimales pour la récolte de tous les bouillons: soya, eaux usées d'amidon, boues non hydrolysées et boues hydrolysées à pH alcalin et température élevée. Après centrifugation, une concentration de 10% en solides dans le bouillon produit une biomasse utilisable pour le développement de la formulation. Le pourcentage d'entomotoxicité décroît avec la vitesse de centrifugation, alors qu'une récupération maximale est obtenue à 48 000 x g. Une récupération de 70% de l'entomotoxicité est obtenue avec une centrifugeuse commerciale opérant à 9000 x g. Les calculs de vitesse de sédimentation pour les différents bouillons fermentés ont permis de calculer le facteur ∑ pour la centrifugeuse commerciale qui était plus élevé pour le milieu à base de soya. De plus, la puissance requise pour la récupération d'entomotoxicité était plus élevée pour le milieu conventionnel à base de soya par rapport aux bouillons fermentés basés sur des eaux usées ou des boues d'épuration. Différents adjuvants, à savoir, des agents de suspension (20% p/v), des phagostimulants (0,5% p/v), des agents adhésifs (0,2% p/v), des agents antimicrobiens (0,5% p/v) et des agents protecteurs contre les rayons UV (0,2% p/v) ont été testés afin de développer des suspensions aqueuses de biopesticides. Ces essais ont permis de définir une formulation comportant :du sorbitol, du monophosphate de sodium, du métabisulfite de sodium comme agents de suspension ; de la mélasse et de la farine de soya comme phagostimulants ; de la mélasse et du lait écrémé en poudre comme adhésifs; de l'acide sorbique et de l'acide propionique comme agents antimicrobiens et, finalement, du lignosulfate de sodium, de la mélasse et du rouge Congo comme écrans protecteurs contre les rayons UV. Les formulations liquides pour les boues non hydrolysées ou des boues hydrolysées comprenant du sorbitol, du monophosphate de sodium et du métabisulfite de sodium donnent de meilleures caractéristiques physiques (viscosité, taille des particules et potentiel de suspension) et biologiques (entomotoxicité et comptes de spores viables) à des pH de 4 et 5 et à des températures entre 4 et 20°C. De la même façon, les formulations stables des eaux usées d'amidon et du soya comportaient du sorbitol, du monophosphate de sodium, et du métabisulfite de sodium en tant qu'agents de suspension. Un effet minime a été observé sur l’entomoxicité et sur la concentration des spores après 120 jours à pH 6 et 6,5 et à des températures de 40 à 50°C, alors que de faibles changements dans la viscosité pouvaient être observés. Les acides sorbique et propionique ont montré un effet anti-microbien plus important et cela est essentiel pour garantir la pureté de la formulation. L'entomotoxicité de la formulation se manifeste par la présence d'enzymes (protéases et chitinases) mélangées à des protéines insecticides. Les chitinases de Bt issues de la fermentation des boues d'épuration ont été caractérisées: une stabilité optimale a été observée à un pH de 4 et à une température de 50°C. Les poids moléculaires des chitinases variaient entre 35 et 45 kDa. Les tests d'exposition aux rayons UV ont permis de mettre en évidence des demi-vies plus longues pour les boues fermentées par rapport au milieu conventionnel: boues non-hydrolysées (11,14 jours) > boues hydrolysées (9,51 jours) > eaux usées de l'amidon (9,02 jours) > soya (2,8 jours). Ces résultats démontrent la faisabilité de produire une formulation stable aqueuse à partir d'eaux usées ou de boues d'épuration fermentées par Bt. Ces résultats serviront de référence pour le développement de formulations sous d'autres formes, comme de la poudre humide ou des capsules qui représentent un grand intérêt en agriculture. Enfin, une étude technico-économique détaillée a été effectuée sur le procédé de production de biopesticides à base de Bt en tenant compte de sept scénarios pour quatre substrats de fermentation, c'est-à-dire: 1) les boues non hydrolysées, 2) les boues hydrolysées, 3) les eaux usées d'amidon et 4) le milieu à base de soya. Il s'agissait de la première étude technico-économique intégrant les résultats des études sur la rhéologie, le traitement en aval et la formulation du présent projet. Les sept scénarios étaient les suivants : 1) les formulations liquides (récolte du bouillon par centrifugation à 9000 x g) ; 2) les formulations liquides (récolte du bouillon par centrifugation à 9000 x g et ultrafiltration par membrane de taille 5 kDa) ; 3) les formulations sèches (récolte du bouillon par centrifugation à 9000 x g) ; 4) les formulations sèches (récolte du bouillon par centrifugation à 9000 x g et ultrafiltration par membrane de taille 5 kDa ); 5) l'ajout de mélasse (phagostimulant à 0,5% p/v dans les formulations); 6) l'ajout de Tween-80 (comme modificateur de la rhéologie à 0,2% p/v pendant la fermentation, seulement pour les boues non hydrolysées) et; 7) procédé de croissance «Fed-Batch» (seulement pour les boues non hydrolysées). Les boues hydrolysées ont donné le plus faible coût de production, soit 0,228 $CAN par milliard d'unités internationales (ou 0,228 $/MUI) pour une capacité en usine de 3 x 10⁷ MIU (3 x 10⁷ MUI/an). Le taux escompté du rendement sur l'investissement était jugé acceptable (supérieur à 40%) pour les matières premières alternatives. L'impact du niveau de production sur les coûts de production n'est pas très significatif ($Can/MUI) : à un niveau de production de 3 x 10⁷ MUI/an, les coûts de production étaient 30 à 45% des coûts de production pour un niveau de production de 7,5 x 10⁶ MUI/an. Les calculs élaborés dans cette étude pourraient éventuellement être appliqués à d'autres procédés de fermentation utilisant des eaux usées et des boues d'épuration comme substrat, tels la production de biopolymères ou de biofertilisants.

Abstract

The present project deals with the feasibility of development of formulations of Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki HD-l (Bt) biopesticides ("value added product") by utilizing wastewater and wastewater sludge as a growth medium. The biopesticide development from alternative raw materials forms a part of the sustainable effort to manage wastewater sludge in an eco-friendly manner. To ascertain the possibility of development of formulations of Bt fermented sludge, detailed rheology studies (viscosity and particle size) of different types of media, namely, primary, secondary and mixed sludge and starch industry wastewater were carried out. Viscosity studies were also carried out on raw, pre-treated (sterilized and thermal alkaline hydrolyzed or both types of treatment) and Bt fermented sludges at different solids concentration (10-40 g/L). Exponential and power laws were preferentially followed by hydrolyzed fermented compared to raw fermented sludge as well as there was an exponential increase in viscosity with solids concentration. The results showed secondary sludge (25 g/L) and starch wastewater to be rheologically compatible for fermentation and formulation development. The alternative fermented media showed pseudoplastic and thixotropic behaviour. Similarly, hydrolyzed secondary sludge showed an improved rheological profile resulting in fermentation broth with higher entomotoxicity and stable formulation. Non-hydrolyzed sludge rheology was also improved by addition of Tween-80 due to improved physical properties of fermentation medium at 25 and higher (30 g/L) total solids concentration. Moreover, the decrease in particle size correlated well with the increase in entomotoxicity and volume distribution of particles was in the lower particle size region of 0.2-12 µm for hydrolyzed sludge. In fact, the particle size distribution pattern of hydrolyzed sludge formulation overlapped with that of commercial formulation. Harvesting pH and temperature for all broths (soya, starch industry wastewater, non- hydrolyzed and thermal alkaline hydrolyzed sludge) were found to be 4-5 and 20°C, respectively. Concentration of broth to 10 % solids produced usable slurry for formulation development. Percent entomotoxicity losses decreased with centrifugal force with maximum Tx recovery at 48 000 g and specific recovery at commercial centrifugal force of 9000 g. The settling velocity calculations for different fermented broths led to the calculation of ∑ factor for continuous commercial centrifuge which was higher for soya medium. Furthermore, power requirements for a given entomotoxicity recovery efficiency were highest for conventional medium (soya) in comparison to wastewater and wastewater sludge based fermented broths. The screening of different adjuvants, namely, suspending agents (20% w/v), phagostimulants (0.5% w/v), stickers (0.2% w/v), anti-microbial agents (0.5% w/v) and UV screens (0.2% w/v) was carried out to develop aqueous biopesticidal suspensions. The screening yielded a formulation which will comprise sorbitol, sodium monophosphate, sodium metabisulphite (suspending agents); molasses, soya flour (phagostimulants); molasses and skimmed milk powder (rainfasteners); sorbic and propionic acids (anti-microbial agents) and sodium lignosulphate; molasses and Congo red (UV screens). Liquid formulations for non-hydrolyzed and hydrolyzed sludge containing sorbitol, sodium monophosphate and sodium metabisulphite yielded improved physical (viscosity, particle size and suspendibility) and biological (spore count and entomotoxicity) characteristics at pH 4-5 and temperatures 4-20°C. Likewise, stable formulations of starch industry wastewater and soya comprised sorbitol and sodium monophosphate as suspending agents. A small effect on entomotoxicity and spore concentration was observed after 120 days at pH 6, 6.5 and temperatures 40 and 50°C and likewise a small viscosity change was also reported. Sorbic and propionic acid provided better anti-microbial properties - mandatory adjuvant of formulation to retain its purity. The entomotoxicity of formulations was a manifestation of presence of enzymes (proteases and chitinases) along with insecticidal proteins. Chitinases originating from Bt based sludge fermentation were characterized and were found to be optimally stable at pH 4.0 and temperature 50°C. The chitinases were found to lie in the 35-45 kDa weight range. UV studies reflected better half-life of formulations vis-à-vis fermented sludges. Half-life of formulations (in days) was found to be in the order: non-hydrolyzed sludge > Thermal alkaline hydrolyzed sludge > starch industry wastewater > soya as 11.14>9.51>9.02>2.8. The formulations were prone to washout during rainfastness studies and this warranted addition of stickers. These results show the probability of forming stable Bt based sludge formulations in the aqueous suspension form. This will lay foundation to develop formulations in other forms like powder and encapsulations to be used in agricultural sector. Further, detailed techno-economic study was carried out on the Bt biopesticides production process taking into account seven scenarios for all the four raw materials, namely, non-hydrolyzed wastewater sludge, hydrolyzed wastewater sludge, starch industry wastewater and soya. The seven scenarios included: a) liquid formulations (harvesting by centrifugation); b) liquid formulations (harvesting by centrifugation and ultrafiltration); c) dry formulations (harvesting by centrifugation); d) dry formulations (harvesting by centrifugation and ultrafiltration); e) Molasses (phagostimulant in formulations); f) Tween-80 (rheology modifier during formulation, only NH sludge) and; g) Fed-batch process (only NH sludge). The hydrolyzed sludge gave the lowest product cost of $Can 0.228/BIU for a Bt plant production capacity of 3 x 10⁷ BIU/year. The discounted cash flow return rate (measure of profitability) was in the acceptable range (» 40 %) for alternative raw materials. The production scale had a large impact on the total per-unit operating cost ($Can/BIU), which at 3 x 10⁷ BIU/year was 30-45% of that at 7.5 x 10⁶ BIU/year. Moreover, the capital and product cost calculations developed in this study can be further extended to the techno- economics of other fermentation technologies to develop value-added products from wastewater/wastewater sludge.

Type de document: Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Tyagi, Rajeshwar Dayal
Co-directeurs de mémoire/thèse: Valéro, José R.
Mots-clés libres: propriétés rhéologiques; fermentation; eaux usées; boues d'épuration; bacillus thuringiensis; biopesticides; environnement
Centre: Centre Eau Terre Environnement
Date de dépôt: 04 juin 2013 19:51
Dernière modification: 11 nov. 2015 19:20
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/1411

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